超多重免疫熒光技術(shù)推動腫瘤微環(huán)境精準(zhǔn)研究

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, 簡稱TME）, 主要由腫瘤細(xì)胞，及其周圍的免疫和炎癥細(xì)胞，腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞，這些細(xì)胞和附近的間質(zhì)組織，微血管, 以及各種細(xì)胞因子和趨化因子構(gòu)成一個復(fù)雜的綜合系統(tǒng)。

腫瘤微環(huán)境是腫瘤賴以生存的環(huán)境。腫瘤細(xì)胞在生長過程中需通過血管供應(yīng)養(yǎng)分。腫瘤浸潤免疫細(xì)胞可能具有抗腫瘤或促腫瘤功能，這兩類細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展的不同階段扮演著不同的角色。抗腫瘤免疫細(xì)胞主要由效應(yīng)性T細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)、M1極化的巨噬細(xì)胞和N1極化的中性粒細(xì)胞組成，可直接發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。而促腫瘤免疫細(xì)胞，主要由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)和髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)組成，通過抑制免疫系統(tǒng)促進(jìn)腫瘤生長。成纖維細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境中數(shù)量最豐富的一類細(xì)胞，是腫瘤微環(huán)境的重要組成成分，它不僅可維持腫瘤微環(huán)境的架構(gòu)，還可為腫瘤供應(yīng)養(yǎng)分。

在腫瘤微環(huán)境研究中，對腫瘤組織的組織結(jié)構(gòu)，腫瘤細(xì)胞和各種免疫細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物的研究，有助于我們更精準(zhǔn)的了解腫瘤微環(huán)境的構(gòu)成。但是既往的免疫組化，傳統(tǒng)免疫熒光等技術(shù)能夠在同一張組織切片中標(biāo)記的靶標(biāo)分子十分有限，不能夠在組織原位上對大量腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的標(biāo)記物進(jìn)行分析，而連續(xù)切片可能導(dǎo)致細(xì)胞空間異位，不能很好的觀察腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞之間的空間位置關(guān)系。
 

今年《Frontiers in Immunology》上發(fā)表的一篇方法學(xué)文章，詳述了利用CODEX技術(shù)，對腫瘤微環(huán)境中的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白進(jìn)行超多重免疫標(biāo)記和組織成像，實現(xiàn)了對8個皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（cutaneous T cell lymphoma，簡稱CTCL)患者樣本的56種標(biāo)記物染色。

這56個標(biāo)記物包含結(jié)構(gòu)標(biāo)記，腫瘤標(biāo)記，免疫細(xì)胞標(biāo)記，反應(yīng)有功能的細(xì)胞的增殖狀態(tài)標(biāo)記和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)標(biāo)記物。下圖展示了在一個組織芯片上56個標(biāo)記物中的7個重要標(biāo)記物的表達(dá)情況。其中，研究人員使用cytokeratin標(biāo)記上皮細(xì)胞，cytokeratin標(biāo)記基質(zhì)層，CD31標(biāo)記血管細(xì)胞，Ki-67標(biāo)記細(xì)胞增殖狀態(tài)，CD3標(biāo)記T細(xì)胞，CD68標(biāo)記巨噬細(xì)胞，Hoechst標(biāo)記細(xì)胞核。


在整個56個標(biāo)記物的panel中，有33個標(biāo)記物用于識別T細(xì)胞，B細(xì)胞，漿細(xì)胞，NK細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，樹突細(xì)胞，郎格罕細(xì)胞，粒細(xì)胞核肥大細(xì)胞。由這56個標(biāo)記物將細(xì)胞分成17種細(xì)胞類型，其中11種類型是免疫細(xì)胞。其中樹突細(xì)胞和郎格罕細(xì)胞被合并稱為抗原呈遞細(xì)胞APCs。免疫細(xì)胞類型共分為抗原呈遞細(xì)胞APCs，B細(xì)胞, CD4+ T細(xì)胞，CD8+ T細(xì)胞，粒細(xì)胞，M1巨噬細(xì)胞，M2巨噬細(xì)胞，肥大細(xì)胞，NK 細(xì)胞，漿細(xì)胞和Tregs。根據(jù)腫瘤組織中免疫細(xì)胞比例，將8個患者劃分為高，中，低三個類群。并通過Voronoi圖生成免疫細(xì)胞類型圖譜。

由于CODEX的超多重免疫熒光解決方案可以觀察到單細(xì)胞水平的蛋白表達(dá)情況。文章作者選取了8個已經(jīng)獲批或正在臨床試驗階段的功能性免疫分子：ICOS，IDO-1，LAG-3， OX40，PD-1，PD-L1，TIM-3和VISTA。觀察這些標(biāo)記物在T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況。

隨著腫瘤免疫治療研究的發(fā)展，腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞類型，免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的空間關(guān)系的精準(zhǔn)檢測需求更加顯現(xiàn)。CODEX超多重免疫熒光染色方案可以實現(xiàn)在1張組織切片上多達(dá)40種以上蛋白標(biāo)記的分析，為精準(zhǔn)的腫瘤微環(huán)境分析提供了有效的工具，幫助研究者和臨床對腫瘤微環(huán)境中的組織結(jié)構(gòu)，空間關(guān)系，免疫細(xì)胞類型乃至細(xì)胞社區(qū)進(jìn)行單細(xì)胞水平的組織原位分析，同時可以實現(xiàn)自動化全片掃描。

[參考信息]
1. Phillips D, Schürch CM, Khodadoust MS, Kim YH, Nolan GP, Jiang S. Highly Multiplexed Phenotyping of Immunoregulatory Proteins in the Tumor Microenvironment by CODEX Tissue Imaging. Front Immunol. 2021 May 19;12:687673.