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單細(xì)胞打印機(jī)在高產(chǎn)細(xì)胞株篩選、基因治療、抗體藥物開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用

瀏覽次數(shù):2577 發(fā)布日期:2022-3-18  來(lái)源:艾貝泰

提升高產(chǎn)細(xì)胞株篩選效率,助力基因治療、抗體藥物等工藝開(kāi)發(fā)——單細(xì)胞打印機(jī)


目前全球生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展處于快速上升期,后疫情時(shí)代的醫(yī)藥健康行業(yè),迎來(lái)新一輪的變革與機(jī)遇。其中,抗體藥物、細(xì)胞與基因治療藥物被認(rèn)為是未來(lái)醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展的主力軍。無(wú)論是抗體藥物的生產(chǎn)還是基于病毒載體的基因治療藥物的制備,都涉及單克隆細(xì)胞株的篩選。在工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中,研發(fā)人員需要分離單細(xì)胞克隆,篩選出高產(chǎn)且穩(wěn)定的細(xì)胞株來(lái)建立種子細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù),用于后續(xù)的病毒載體或抗體等藥物的生產(chǎn)。

2020年,美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)更新了關(guān)于基因治療臨床試驗(yàn)申請(qǐng)(INDs)的化學(xué)、制造和控制指導(dǎo)原則(Chemistry, Manufacturing, and Control Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications),內(nèi)容包含穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株開(kāi)發(fā)及細(xì)胞克隆性確證等。文件指出,細(xì)胞庫(kù)(Cell bank)的穩(wěn)定性及純度是一個(gè)需要考慮的重要方面(https://www.fda.gov)。非單克隆來(lái)源的細(xì)胞群中,其細(xì)胞異質(zhì)性相對(duì)較高,外源蛋白產(chǎn)量低的細(xì)胞系往往與蛋白高產(chǎn)的細(xì)胞群體競(jìng)爭(zhēng),導(dǎo)致高產(chǎn)細(xì)胞個(gè)體占比越來(lái)越少,最終隨著傳代次數(shù)的增加,導(dǎo)致細(xì)胞庫(kù)或工作庫(kù)的質(zhì)量下降,因此,通過(guò)單克隆細(xì)胞篩選是提高病毒載體質(zhì)量的重要步驟。單克隆源性的確證是一種控制細(xì)胞種群降低其異質(zhì)性的方法,通過(guò)防止異種細(xì)胞群體的產(chǎn)生,來(lái)保障未來(lái)生產(chǎn)出的病毒產(chǎn)品的質(zhì)量不受影響。CEVEC公司(CEVEC Pharmaceuticals)針對(duì) ELEVECTA® AAV包裝細(xì)胞系的研究數(shù)據(jù)顯示,通過(guò)單克隆篩選出的細(xì)胞株其AAV產(chǎn)量要比非單克隆細(xì)胞來(lái)源的高10倍左右(https://cevec.com)。除了細(xì)胞基因治療產(chǎn)品,針對(duì)抗體藥物,F(xiàn)DA的政策法規(guī)也要求工藝生產(chǎn)細(xì)胞系須是從單個(gè)祖細(xì)胞克隆來(lái)源的,生物制藥企業(yè)需提供有力的數(shù)據(jù)證據(jù)以證明藥物研發(fā)過(guò)程中的單克隆源性,上述相關(guān)的政策法規(guī)對(duì)藥物開(kāi)發(fā)制備工藝中細(xì)胞單克隆篩選操作及細(xì)胞單克隆源性確證提出了更高的要求。

目前常見(jiàn)的單克隆細(xì)胞篩選方法,包括有限稀釋法、半固體培養(yǎng)基篩選法、流式細(xì)胞術(shù)分選及單細(xì)胞分離法等。有限稀釋法、半固體培養(yǎng)基篩選法的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)細(xì)胞的物理?yè)p傷小,弊端是耗時(shí)長(zhǎng)、效率低,此外,半固體培養(yǎng)基篩選法采用的熒光抗體對(duì)細(xì)胞有毒性,會(huì)影響細(xì)胞活性;并且在半固體培養(yǎng)基上篩選出的高產(chǎn)細(xì)胞,轉(zhuǎn)移到懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)可能并不高產(chǎn)。流式細(xì)胞術(shù)的分選效率高,但是由于流式細(xì)胞術(shù)分選采用的內(nèi)部壓力及其高頻震蕩對(duì)細(xì)胞造成的損傷較大,分選下來(lái)的細(xì)胞活性不高。篩選過(guò)程對(duì)細(xì)胞的物理或化學(xué)損傷是造成細(xì)胞單克隆率降低的原因之一,除此之外,篩選前細(xì)胞的狀態(tài)對(duì)于篩選后是否形成高產(chǎn)的細(xì)胞群落也很重要,若是篩選前細(xì)胞狀態(tài)已經(jīng)不好,篩選后其狀態(tài)也難以變好,何況篩選過(guò)程會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定的損傷,更不會(huì)奢望其狀態(tài)會(huì)變好。

綜上所述,尋找一種分選效率高,篩選出的陽(yáng)性克隆細(xì)胞成活率高、生長(zhǎng)率高,且單克隆源性證據(jù)可追溯的篩選方法或技術(shù)平臺(tái)對(duì)于涉及單克隆細(xì)胞篩選的基因治療、抗體等生物醫(yī)藥行業(yè)顯得尤為重要。

德國(guó) Cytena 公司開(kāi)發(fā)的單細(xì)胞打印機(jī)(SCP)采用的芯片包含專利的硅膜設(shè)計(jì),電子控制的制動(dòng)板輕輕擠壓腔體導(dǎo)致腔體體積變小,產(chǎn)生液滴,通過(guò)高分辨率的CCD相機(jī)確認(rèn)只含一個(gè)細(xì)胞且該細(xì)胞直徑和細(xì)胞圓度符合設(shè)定范圍的液滴落進(jìn)96/384孔板中,不含細(xì)胞的空液滴和含兩個(gè)及以上細(xì)胞的液滴被氣動(dòng)閥門吸走。通過(guò)設(shè)定細(xì)胞直徑和細(xì)胞圓度的質(zhì)控分選過(guò)程,不僅提高了單細(xì)胞的分選效率,也篩選到了狀態(tài)更好的細(xì)胞,提高了單克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)率。

 

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1. Cytena 單細(xì)胞打印機(jī)工作原理圖


單細(xì)胞的證據(jù)可追溯性,在cartridge分離細(xì)胞前后的過(guò)程中,會(huì)連續(xù)拍取多張細(xì)胞圖片,證實(shí)克隆來(lái)自于單個(gè)細(xì)胞。
 

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圖2. cartridge分離細(xì)胞前后的過(guò)程圖 


Cytena單細(xì)胞打印機(jī)進(jìn)入國(guó)內(nèi)以來(lái),受到國(guó)內(nèi)各大藥企的青睞,得到了眾多用戶的的積極反饋和認(rèn)可。


具體案例分享
 

一、下面給出了不同地區(qū)一些客戶反饋的單細(xì)胞克隆成活率及單克隆細(xì)胞拍照?qǐng)D。
 

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3不同客戶使用Cytena單細(xì)胞打印機(jī)得到的單細(xì)胞克隆成活率數(shù)據(jù)
 

(1)杭州客戶
 

(見(jiàn)下圖)左圖為單細(xì)胞打印機(jī)分選后Day14天拍照?qǐng)D, 右圖為有限稀釋法分選后Day14天拍照?qǐng)D。
 

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結(jié)論:SCP分選出的細(xì)胞幾乎都是單細(xì)胞,有限稀釋大部分都是空孔。SCP長(zhǎng)出來(lái)的單克隆數(shù)(70個(gè))幾乎是有限稀釋的4倍(18個(gè))。


(2)南京客戶
 

一共分選2組樣品,在有限稀釋法分選很難生長(zhǎng)的細(xì)胞,通過(guò)SCP分選后,都獲得了66-75個(gè)單克隆細(xì)胞株,證實(shí)SCP通過(guò)細(xì)胞直徑,細(xì)胞圓度等質(zhì)控方式能篩選到狀態(tài)好的細(xì)胞,提高單克隆率。


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(3)上海客戶
 

單細(xì)胞打印機(jī)分選的 96 孔板最終獲得的克隆數(shù)目是有限稀釋法的 4.3 倍。
 

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(4)東北客戶
 

SCP的分選效率高(如下圖所示),除了周邊孔受到蒸發(fā)效應(yīng)影響生長(zhǎng),中間的孔都是單克隆來(lái)源的細(xì)胞,且生長(zhǎng)良好。(細(xì)胞類型:CHO細(xì)胞)
 

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(5)成都客戶
 

根據(jù)統(tǒng)計(jì),一塊384孔板除去陽(yáng)性對(duì)照孔,一共對(duì)378個(gè)孔進(jìn)行了單細(xì)胞分選(統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)下表),對(duì)分選過(guò)程中的噴嘴成像、3D全孔成像以及后續(xù)的底板成像進(jìn)行評(píng)估,噴嘴成像顯示得到單細(xì)胞孔378個(gè),即單細(xì)胞率100%;3D全孔成像顯示得到的單細(xì)胞孔374個(gè),即單細(xì)胞率98.9%;這也充分表明噴嘴成像和3D全孔成像可以相互佐證,使我們的單細(xì)胞率的正確率無(wú)限接近100%;生長(zhǎng)7天后,330個(gè)孔成功生長(zhǎng)成單細(xì)胞克隆團(tuán),單克隆率為88.2%。
 

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二、客戶評(píng)價(jià)
 

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三、部分客戶名單
 

貨物名稱

儀器型號(hào)

最終用戶

單細(xì)胞打印機(jī)

scp

藥明生物

單細(xì)胞打印機(jī)

f.sight

信達(dá)生物

單細(xì)胞打印機(jī)

f.sight

蘇州康聚生物

單細(xì)胞打印機(jī)

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君盟生物

單細(xì)胞打印機(jī)

c.sight

齊魯制藥上海研發(fā)中心

單細(xì)胞打印機(jī)

c.sight

北京昭衍生物

單細(xì)胞打印機(jī)

f.sight

成都康諾行生物醫(yī)藥科技有限公司

單細(xì)胞打印機(jī)

c.sight

三優(yōu)生物醫(yī)藥

單細(xì)胞打印機(jī)

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深圳樂(lè)士生物科技有限公司

單細(xì)胞打印機(jī)

f.sight

中國(guó)科學(xué)院藥物創(chuàng)新研究院中山研究院(達(dá)石)

單細(xì)胞打印機(jī)

f.sight

煙臺(tái)邁百瑞國(guó)際生物醫(yī)藥有限公司

單細(xì)胞打印機(jī)

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澤景生物

單細(xì)胞打印機(jī)

c.sight

皓陽(yáng)生物

單細(xì)胞打印機(jī)

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科望生物

單細(xì)胞打印機(jī)

f.sight

麗珠生物

單細(xì)胞打印機(jī)

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復(fù)宏漢霖

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宜明昂科

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養(yǎng)生堂

單細(xì)胞打印機(jī)

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智享生物

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尚健生物

單細(xì)胞打印機(jī)

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寶船生物

單細(xì)胞打印機(jī)

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再鼎生物

單細(xì)胞打印機(jī)

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康寧杰瑞

單細(xì)胞打印機(jī)

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艾米能斯

單細(xì)胞打印機(jī)

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漢騰生物

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鼎康生物(武漢)

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海正生物

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艾迪基因

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武漢大學(xué)

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長(zhǎng)春金賽

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特瑞斯

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康抗生物

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至善唯新生物科技

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中科新生命

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關(guān)于Cytena公司


 
Cytena公司潛心研究單細(xì)胞打印機(jī)技術(shù)多年,不斷升級(jí)設(shè)備功能,以一貫溫和的分選原理、更加快速的分選效率、更加簡(jiǎn)易的操作步驟,助力抗體、細(xì)胞治療、基因治療、干細(xì)胞等研究領(lǐng)域的客戶快速搭建單細(xì)胞篩選平臺(tái)。艾貝泰生物科技有限公司作為Cytena的單細(xì)胞打印機(jī)總代理商,為您提供最優(yōu)質(zhì)的售前售后服務(wù)。
 
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