單細(xì)胞+空間轉(zhuǎn)錄組+多重免疫熒光，揭示結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的免疫動(dòng)態(tài)變化

工欲善其事，必先利其器！先進(jìn)的技術(shù)總是能助力科研工作者拿到更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果！而10x Genomics單細(xì)胞+Visium空間轉(zhuǎn)錄組，再結(jié)合上Akoya的多重免疫熒光，更是強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)手！這不，復(fù)旦大學(xué)高強(qiáng)團(tuán)隊(duì)聯(lián)合中科院巴斯德研究所張曉明團(tuán)隊(duì)，利用這些技術(shù)，深入解析了結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的免疫動(dòng)態(tài)變化，研究成果于2021年8月20日發(fā)表在Cancer Discovery （IF=39.40）雜志上，真是可喜可賀！接下來，小編將帶領(lǐng)大家一睹這篇大作的風(fēng)采。

文章題目：Spatiotemporal Immune Landscape of Colorectal Cancer Liver Metastasis at Single-Cell Level

發(fā)表期刊：Cancer Discovery

發(fā)表時(shí)間：2021年8月20日

發(fā)表單位：復(fù)旦大學(xué)，中科院巴斯德研究所

肝轉(zhuǎn)移（LM）是結(jié)直腸癌（CRC）死亡的主要原因，表現(xiàn)出高度的免疫微環(huán)境異質(zhì)性和抑制性。 本研究使用10x Genomics單細(xì)胞 RNA-seq 和Visium空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)對 97 個(gè)匹配的樣本進(jìn)行了測序。 值得注意的是，轉(zhuǎn)移性微環(huán)境經(jīng)歷了顯著的免疫抑制細(xì)胞空間重編程，如 MRC1+ CCL18 + M2 樣巨噬細(xì)胞。本研究進(jìn)一步開發(fā)了 scMetabolism，這是一種用于量化單細(xì)胞代謝的計(jì)算方法，并觀察到這些巨噬細(xì)胞具有增強(qiáng)的代謝活性。有趣的是，新輔助化療（NAC）可以阻斷這種狀態(tài)并恢復(fù)反應(yīng)性患者的抗腫瘤免疫平衡，而無反應(yīng)性患者則惡化為更具抑制性的狀態(tài)。本研究描述了轉(zhuǎn)移的免疫進(jìn)化，并揭示了腫瘤如何對新輔助化療做出反應(yīng)。

本研究的樣本來自于復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院收集的病理診斷為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（CRLM）的樣本。其中：

1. 來自 20 名患者（n = 11，未治療；n = 5，PD/SD；n = 4，PR）的 89 個(gè)樣本進(jìn)行了10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。

2. 來自 4 名患者（n = 2，未治療；n = 2, PR) 的8個(gè)樣本進(jìn)行了10x Genomics Visium空間轉(zhuǎn)錄組測序。

3. 另外，來自 27 名患者的104 個(gè)樣本進(jìn)行了Akoya多重免疫熒光分析。(n = 18, 未治療; n = 9, NAC-PR)。

1. 單細(xì)胞結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)精確量化結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移腫瘤免疫微環(huán)境多樣性

本研究通過10x Genomics單細(xì)胞技術(shù)共捕獲了 178,630 個(gè) CD45+ 細(xì)胞，平均每個(gè)樣本包含2,007 個(gè)細(xì)胞，基因中位數(shù)為 178,630 個(gè) 基因。經(jīng)過細(xì)胞聚類分析，本研究定義了主要的細(xì)胞類型。與之前的結(jié)腸癌 scRNA-seq 基本一致。研究人員從 CRLM 樣本中鑒定了髓細(xì)胞、CD8+ T 細(xì)胞、CD4+ T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和 B 細(xì)胞。值得注意的是，不同組織類型的 T 細(xì)胞比例明顯不同，這表明了免疫微環(huán)境的組織異質(zhì)性。在CRC 和配對的LM 中，Treg 細(xì)胞約占所有 CD45+ 細(xì)胞比例的 10% ，而這些細(xì)胞在相鄰的正常組織中則很少。這表明腫瘤內(nèi)免疫受到抑制，這之前歸因于肝轉(zhuǎn)移中免疫治療效果的降低。

同時(shí)，本文開展了10x Genomics Visium空間轉(zhuǎn)錄組研究，通過無監(jiān)督聚類分析將樣品分為不同的區(qū)域，例如腫瘤和成纖維細(xì)胞區(qū)域。隨后將 scRNA-seq 和 ST 數(shù)據(jù)利用Seurat軟件進(jìn)行整合，量化主要免疫亞群。該研究發(fā)現(xiàn)免疫微環(huán)境顯示出從原發(fā)部位到轉(zhuǎn)移部位的動(dòng)態(tài)細(xì)胞和空間變化。在 新輔助化療（NAC） 治療后，免疫表型在有反應(yīng)的患者中經(jīng)歷了抗腫瘤重塑，但在無反應(yīng)的患者中轉(zhuǎn)向更多的免疫抑制，其中免疫抑制細(xì)胞在轉(zhuǎn)移部位重新編程。

2. 通過多種技術(shù)手段驗(yàn)證腫瘤免疫微環(huán)境特征

接下來本研究通過另外三個(gè)獨(dú)立的 CRLM 隊(duì)列來驗(yàn)證上述發(fā)現(xiàn)。首先本研究利用Akoya多重免疫熒光技術(shù)定量分析同一醫(yī)院另外 27 名 CRLM 患者（n = 18，未治療；n = 9，NAC-PR）中所選樣本的免疫細(xì)胞亞群的空間分布。研究人員觀察到，在未治療的樣本中， CRC 和 LM 中 FOXP3+ Treg 細(xì)胞、MRC1+ CCL18+ 巨噬細(xì)胞和 SPP1+ 巨噬細(xì)胞的浸潤顯著增加，這與前面的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)基本一致。其次，本研究利用 ssGSEA 對 CRLM 的大量微陣列數(shù)據(jù)集中的免疫細(xì)胞進(jìn)行評分。由于缺乏鄰近組織數(shù)據(jù)，我們只能檢查原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤之間的細(xì)胞豐度。根據(jù)前面的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)，在該驗(yàn)證隊(duì)列中，MRC1+ CCL18+ 巨噬細(xì)胞、SPP1+ 巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在轉(zhuǎn)移性腫瘤中均顯著更高。第三，本研究探討了癌癥基因組圖譜 (TCGA) CRC 隊(duì)列 中 scRNA-seq 定義的免疫細(xì)胞亞群的預(yù)后價(jià)值。MRC1+ CCL18+ 巨噬細(xì)胞和 SPP1+ 巨噬細(xì)胞在原發(fā)性腫瘤中的高評分均預(yù)測預(yù)后顯著較差。總而言之，本研究的 CRLM 單細(xì)胞和空間免疫景觀可以在獨(dú)立的隊(duì)列中得到驗(yàn)證，表明本研究數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。這些觀察結(jié)果還使我們假設(shè)特定的巨噬細(xì)胞亞群可能在 CRLM 的促腫瘤生態(tài)位形成中發(fā)揮重要作用。

本研究繪制了結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，并在轉(zhuǎn)移部位發(fā)現(xiàn)了高度代謝激活的 MRC1+CCL18+M2 樣巨噬細(xì)胞。有效的新輔助化療可以減緩這種代謝激活，提高靶向轉(zhuǎn)移代謝途徑的可能性。