轉(zhuǎn)錄組測序+IP-MS揭示糖尿病潰瘍潛在治療靶點

近日，上海市皮膚病醫(yī)院院長，上海市中醫(yī)藥研究院皮膚病研究所所長李斌教授團隊在皮膚科頂刊JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY（IF：8.551/Q1）上發(fā)表了題為PD-L1 Triggered by Binding eIF3I Contributes to the Amelioration of Diabetes-Associated Wound Healing Defects by Regulating IRS4的研究論文，報道了糖尿病潰瘍的潛在治療靶點。該研究中的轉(zhuǎn)錄組測序及IP-MS由上海生物芯片有限公司（生物芯片上海國家工程研究中心）完成。

原文鏈接：https://www.jidonline.org/article/S0022-202X(21)01460-3/fulltext

研究內(nèi)容

持續(xù)的慢性炎癥和上皮化延遲會導(dǎo)致糖尿病潰瘍（DUs）延遲愈合。PD-L1在愈合缺陷中具有抗炎和增殖活性的功能，但其在DU發(fā)病機制中的作用尚不清楚。在DU組織中發(fā)現(xiàn)PD-L1水平較低，外源性PD-L1在愈合過程中具有治療作用，可以加速再上皮化，并減輕會導(dǎo)致傷口延遲閉合的長期炎癥反應(yīng)。研究利用轉(zhuǎn)錄組測序檢測PD-L1的下游效應(yīng)子，并利用免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜（IP-MS）和免疫共沉淀篩選其相互作用的蛋白。在體內(nèi)和體外對eIF3I-PD-L1-IRS4信號通路的生物學(xué)功能進行檢測。最后，通過免疫組化驗證了eIF3I、PD-L1和IRS4在人類臨床樣本DU組織中的表達水平。在機制上，PD-L1與eIF3I結(jié)合，通過下調(diào)IRS4促進皮膚糖尿病創(chuàng)面愈合。這些發(fā)現(xiàn)表明，eIF3I/PD-L1/IRS4信號通路有助于傷口愈合缺陷，可以作為DU中潛在的治療靶點。

研究思路

1. PD-L1在體內(nèi)對DU有治療作用

研究者首先建立了小鼠糖尿病潰瘍（DU）動物模型，以闡明表皮角質(zhì)細胞中的PD-L1是否與傷口延遲愈合的發(fā)展有關(guān)系。通過比較DU創(chuàng)面中PD-L1的表達水平發(fā)現(xiàn)與正常創(chuàng)面相比，PD-L1在DU處明顯下調(diào)，并在PD-L1蛋白處理后得到回復(fù)，提示PD-L1缺陷可能與DU愈合延遲有關(guān)。進一步實驗表明PD-L1比重組牛堿性成纖維細胞生長因子（rb-bFGF）具有更高的創(chuàng)面愈合效率，且PD-L1可以使創(chuàng)面組織形成、炎癥消退，這與rb-bFGF的治療結(jié)局相似。在安全性上，對建立后第九天的DU模型檢測肝腎功能未發(fā)現(xiàn)明顯的安全性問題。這些結(jié)果表明外部施用PD-L1會導(dǎo)致上皮化加速和炎癥緩解，DU的愈合障礙可能是因為內(nèi)源性PD-L1缺乏所致。

圖1 PD-L1可改善DU缺陷、HaCaT細胞增殖/遷移和炎癥反應(yīng)

2. PD-L1促進HaCaT細胞增殖/遷移并減輕炎癥

根據(jù)前人的研究已知PD-L1在靶向角質(zhì)細胞的再上皮化過程中起作用，研究者使用PD-L1過表達的HaCaT細胞，發(fā)現(xiàn)上調(diào)PD-L1顯著促進了細胞增殖、遷移，并顯示了抗炎作用。無論是體內(nèi)研究還是體外部分，PD-L1可通過減輕慢性炎癥反應(yīng)和促進角質(zhì)細胞的增殖與遷移來改善DU創(chuàng)面愈合缺陷。

圖2 PD-L1促進HaCaT細胞增殖/遷移，減少炎癥

3. PD-L1的轉(zhuǎn)錄圖譜--過表達HaCaT細胞

為了進一步確定PD-L1對傷口修復(fù)的影響，利用RNA測序檢測了PD-L1過表達和正常HaCaT細胞的轉(zhuǎn)錄譜。結(jié)果表明PD-L1過表達和正常HaCaT細胞的mRNA表達狀態(tài)存在很大差異，并且差異表達（DE）的mRNAs可能受PD-L1調(diào)節(jié)，從而改善傷口愈合。此外，進行了GO和KEGG通路富集分析（圖2c和d）。結(jié)果表明，PD-L1在HaCaT細胞中的過表達上調(diào)了參與傷口愈合的DE mRNAs，有利于組織重建，并下調(diào)了與炎癥機制與免疫反應(yīng)相關(guān)的DE mRNAs。

圖3 PD-L1改變了HaCaT細胞的轉(zhuǎn)錄組特征

4. IRS4 是加重DU缺陷的PD-L1 下游效應(yīng)器

從上述研究結(jié)果可知，IRS4是下調(diào)最顯著的差異mRNA，接下來確定IRS4在正常創(chuàng)面、DU創(chuàng)面和PD-L1處理的DU創(chuàng)面中的表達情況。DU處檢測到IRS4的高表達，并與DU創(chuàng)面中PD-L1的缺失相關(guān)。說明IRS4可能在DU恢復(fù)過程中起到抑制作用。為了進一步驗證IRS4在HaCaT細胞中的生物學(xué)功能，使用針對人IRS4的小干擾RNA（small interfering RNAs，siRNAs）敲除IRS4，用過表達質(zhì)粒上調(diào)IRS4。結(jié)果表明，IRS4的存在通過減少細胞增殖/遷移和增強炎癥浸潤，破壞了愈合重建的生物學(xué)過程。為了確定PD-L1與IRS4 的功能關(guān)系，采用針對人PD-L1的siRNAs 敲除PD-L1。IRS4在PD-L1敲除的細胞中表達較高，而在PD-L1過表達的細胞中IRS4表達降低。這些結(jié)果表明IRS4是PD-L1的下游效應(yīng)器。此外，挽救實驗驗證發(fā)現(xiàn)IRS4過表達可以部分逆轉(zhuǎn)PD-L1過表達介導(dǎo)的細胞增殖/遷移增加和炎癥減弱。綜上所述，PD-L1通過抑制IRS4的表達來改善細胞表型。

圖4 IRS4活性受PD-L1直接或部分負向調(diào)控

5. eIF3I與PD-L1相互作用

為了識別與PD-L1相互作用的細胞蛋白，利用過表達PD-L1的細胞進行了免疫沉淀和質(zhì)譜實驗。質(zhì)譜分析鑒定出107個特異性結(jié)合PD-L1的蛋白。此外，研究者采用生物信息學(xué)分析，應(yīng)用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)eIF3I可能在PD-L1引導(dǎo)的翻譯調(diào)控中發(fā)揮核心作用。此外，作者通過免疫共沉淀試驗驗證了eIF3I和PD-L1之間的相互作用。

圖5 EIF3I與PD-L1相互作用

6. eIF3I通過PD-L1/IRS4信號通路改變DU相關(guān)的疾病狀態(tài)

研究發(fā)現(xiàn)eIF3I基因敲除可顯著抑制細胞增殖/遷移，增加炎癥浸潤，而過表達eIF3I則顯示相反的結(jié)果。這表明eIF3I對DU的愈合有積極的作用，并可能通過PD-L1介導(dǎo)的生物學(xué)過程發(fā)揮作用。

Western blot結(jié)果顯示，eIF3I敲除可以降低PD-L1的表達水平，增加IRS4的表達水平，而過表達eIF3I則得到相反結(jié)論。進一步檢測eIF3I調(diào)節(jié)PD-L1/IRS4信號通路的功能，發(fā)現(xiàn)eIF3I過表達挽救了依賴于PD-L1敲除的細胞增殖/遷移的減少和炎癥的惡化。此外，IRS4的過表達部分抵消了eIF3I過表達和PD-L1敲除誘導(dǎo)的影響。綜上所述，eIF3I至少部分地通過PD-L1/IRS4信號通路加速增殖/遷移并抵抗炎癥。

圖6 EIF3I通過調(diào)節(jié)PD-L1/IRS4信號通路促進細胞增殖/遷移并減輕炎癥

7. eIF3I、PD-L1和IRS4在人DU中的表達

為了驗證eIF3I/PD-L1/IRS4信號通路在臨床中的作用，使用糖尿病創(chuàng)面皮膚和正常皮膚樣本研究eIF3I、PD-L1和IRS4的激活狀態(tài)。在糖尿病傷口創(chuàng)面，炎癥指標(biāo)CD45⁺、MPO⁺和CD68⁺與正常皮膚組織相比明顯增加。值得注意的是，與正常樣本相比，糖尿病創(chuàng)面皮膚樣品中eIF3I和PD-L1的細胞質(zhì)染色下降，而IRS4染色在糖尿病創(chuàng)面中增加。臨床樣本結(jié)合體內(nèi)外實驗結(jié)果提示eIF3I/PD-L1/IRS4信號通路是治療DU的潛在靶點。

圖7 糖尿病潰瘍患者組織中eIF3I、PD-L1和IRS4的相關(guān)性

研究結(jié)論

研究綜合轉(zhuǎn)錄組測序+IP-MS研究策略，發(fā)現(xiàn)eIF3I/PD-L1/IRS4信號通路有助于傷口愈合缺陷，可以作為DU中潛在的治療靶點，為糖尿病潰瘍延遲愈合的治療帶來新的希望。