單細胞轉(zhuǎn)錄組+16s聯(lián)合腸道微生物揭示乳酸菌化身胰腺癌“幫兇”的機制

傳統(tǒng)認知里，乳酸菌是促進胃腸道功能的有益菌群，在工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)、食品和醫(yī)藥等與人類生活密切相關(guān)的重要領(lǐng)域具有極高的應(yīng)用價值。近日，來自多倫多大學(xué)的Tracy L. McGaha教授團隊在Immunity (IF 31.428)上發(fā)表了題為“Tryptophan-derived microbial metabolites activate the aryl hydrocarbon receptor in tumor-associated macrophages to suppress anti-tumor immunity”的學(xué)術(shù)研究，打破了人們對乳酸菌的固有印象，該研究運用單細胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)聯(lián)合腸道微生物，證明了乳酸菌通過色氨酸代謝途徑激活腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAM）芳香氫受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）的活性，最終促進腫瘤生長并破壞免疫檢查點的抑制效果。

研究材料
荷瘤小鼠；AhR缺陷型荷瘤小鼠

技術(shù)路線
· 步驟1：轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)揭示AhR控制胰腺癌中腫瘤相關(guān)巨噬細胞的功能；
· 步驟2：單細胞轉(zhuǎn)錄組驗證巨噬細胞中AhR功能對胰腺癌的影響；
· 步驟3：微生物測序結(jié)果表明AhR在腫瘤巨噬細胞中被乳酸菌產(chǎn)生的色氨酸代謝物激活；
· 步驟4：膳食色氨酸是PDAC TME中免疫表型的關(guān)鍵驅(qū)動因素；
· 步驟5：AhR在人腫瘤巨噬細胞中表達富集，并與生存相關(guān)。

研究結(jié)果

1. AhR是促腫瘤表型的關(guān)鍵驅(qū)動因素
為了了解巨噬細胞在胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）中的作用，作者首先比較了PDAC中TAM和正常巨噬細胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)果TAM顯示出880個基因的上調(diào)表達，包括促癌基因Arg1、Nos2和Cd274，以及編碼AhR的基因Cyp1b1。
前人的研究表明，AhR是一種有效的免疫調(diào)節(jié)因子，為了測試AhR在PDAC中是否具有免疫調(diào)控作用，作者構(gòu)建了Lyz2^cre/+Ahr^fl/fl（AhR缺陷型）小鼠模型，發(fā)現(xiàn)在AhR缺陷的小鼠中CD45表達下降，MHCII, CD40 和PDL1表達增加，以及促癌基因（Arg1和Ido1）的表達下調(diào)和促炎基因（Il1b、Gzb和MHCII）表達上調(diào)，這些結(jié)果均表明AhR的免疫調(diào)控作用。此外，作者還發(fā)現(xiàn)在AhR缺陷的小鼠中CD8⁺ T細胞活化數(shù)量增加，而腫瘤的重量和浸潤性癌的比例明顯低于TAM，ROC曲線也表明AhR缺陷的小鼠具有更好的存活率。

圖1 AhR缺陷驅(qū)動TAM和CD8⁺T細胞的炎癥極化

2. AhR重塑PDAC中的轉(zhuǎn)錄景觀 
為了了解巨噬細胞中AhR功能對TME的影響，作者對腫瘤組織和AhR缺陷腫瘤組織進行了質(zhì)譜流式和單細胞轉(zhuǎn)錄組分析，均鑒定出3個巨噬細胞簇。iGSEA富集分析表明AhR缺陷影響了包括干擾素響應(yīng)通路，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，且PDAC TME中的巨噬細胞群體表現(xiàn)出具有前腫瘤、替代極化狀態(tài)特征的轉(zhuǎn)錄譜。

圖2  AhR重塑PDAC中的免疫轉(zhuǎn)錄景觀
 

3.乳酸菌通過色氨酸代謝途徑激活A(yù)hR
由于AhR是色氨酸代謝產(chǎn)生的受體，接下來，作者擬尋找在TME中驅(qū)動AhR活性的配體來源。前人的研究表明，乳酸菌能夠通過色氨酸代謝產(chǎn)生吲哚，且乳酸菌是炎癥性疾病骨髓細胞中AhR活性的重要驅(qū)動因素。于是作者使用乳酸菌不耐受的Amp和耐受的Vanc分別處理荷瘤小鼠，腸道微生物檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗生素Amp降低了乳酸菌的相對豐度，且Amp抑制乳酸菌之后能夠有效的提高MHCII和PD-L1的表達來提高免疫應(yīng)答效果，從而抑制腫瘤的生長。該數(shù)據(jù)表明抗生素治療、乳酸菌調(diào)節(jié)以及腫瘤內(nèi)免疫調(diào)控之間潛在的聯(lián)系。
通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)乳酸菌L. reuteri和L. murinus能產(chǎn)生吲哚類物質(zhì)激活A(yù)hR，且L. murinus的產(chǎn)量更多。隨后作者測試了L. murinus是否會影響PDAC中的腫瘤生長和炎癥，在無菌小鼠腸道中移植L. murinus后研究其對腫瘤生長的影響，結(jié)果顯示L. murinus不僅能夠促進PDAC腫瘤生長，增加AhR活性，還能促進Arg1, Ido1, Il10等促癌基因的表達，這表明L. murinus可以驅(qū)動TAMs獲得免疫抑制程序。

圖3 乳酸菌驅(qū)動TME中的免疫抑制
 

4. 飲食影響腫瘤生長及免疫調(diào)控
由于色氨酸代謝是激活A(yù)hR的關(guān)鍵機制，作者測試了通過調(diào)整飲食去除色氨酸是否會影響腫瘤的生長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去除色氨酸后腫瘤重量顯著降低，而在飲食中加入吲哚之后，又能顯著的增加腫瘤重量。這些數(shù)據(jù)表明，膳食色氨酸是PDAC TME中免疫表型的關(guān)鍵驅(qū)動因素。

圖4 膳食中色氨酸和吲哚可促進免疫抑制和PDAC生長

5. AHR表達和活性與人胰腺導(dǎo)管腺癌的患者預(yù)后相關(guān)
隨后，通過胰腺癌TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，低表達AhR有利于生存，且PDAC TCGA隊列中AhR表達特征與T細胞和巨噬細胞基因表達呈負相關(guān)。

圖5 AhR的活性與人類PDAC患者的預(yù)后有關(guān)

小編小結(jié)
文章聚焦于腸道菌群對腫瘤的免疫調(diào)控，運用單細胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)聯(lián)合腸道微生物，揭示了乳酸菌通過代謝食物中的色氨酸，激活腫瘤相關(guān)巨噬細胞，促進腫瘤生長的機制，為更個性化的癌癥治療指明了方向。
 

中科優(yōu)品推薦
【中科新生命】重點布局單細胞多組學(xué)平臺，先后建立了基于10x Genomics 新的Chromium X的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序平臺以及“一站式”單細胞蛋白質(zhì)組服務(wù)平臺。其中，Chromium X作為當(dāng)前業(yè)內(nèi)通量最高的單細胞測序平臺之一，可以實現(xiàn)百萬級細胞通量檢測，為大規(guī)模單細胞圖譜、高通量藥物篩選、稀有細胞鑒定分析等需求提供助力。