單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組+16S揭示腸道微生物或能為機(jī)體免疫系統(tǒng)“充電”

腸道微生物群的組成與腫瘤的發(fā)展和抗腫瘤免疫的功效有關(guān)。匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院Timothy Hand教授研究團(tuán)隊(duì)在Immunity (31.428)雜志上發(fā)表了一篇研究論文，名為“Microbiota-specific T follicular helper cells drive tertiary lymphoid structures and anti-tumor immunity against colorectal cancer”，揭示了帶有免疫原性腸道細(xì)菌肝螺桿菌（Hhep）定殖結(jié)腸腫瘤小鼠，誘導(dǎo)Hhep特異性T濾泡輔助細(xì)胞和腫瘤鄰近的三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（TLSs）擴(kuò)張，從而促進(jìn)抗腫瘤免疫。
研究材料
AOM-DSS模型鼠、AOM-DSS+Hhep小鼠

技術(shù)路線
· 步驟1：表型數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)Hhep定殖介導(dǎo)了結(jié)腸癌中強(qiáng)大的抗腫瘤作用；
· 步驟2：?jiǎn)渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示Hhep定殖增加細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)并促使TLSs的擴(kuò)張；
· 步驟3：Tfh 細(xì)胞是 Hhep 介導(dǎo)的腫瘤控制和免疫浸潤(rùn)所必需的。

研究結(jié)果
1. Hhep定殖重塑結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境
前人的研究表明，Hhep菌（一種具有內(nèi)在免疫原性的腸道細(xì)菌）定殖荷瘤小鼠引發(fā)的特異性免疫反應(yīng)可修飾結(jié)腸癌微生物群結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致抗腫瘤免疫增強(qiáng)。本研究，作者將Hhep菌定殖于生長(zhǎng)7周的結(jié)直腸癌（CRC）小鼠模型中，相對(duì)于對(duì)照組（荷瘤小鼠無(wú)Hhep菌定殖），Hhep定殖顯著減少了腫瘤的數(shù)量和大小，延長(zhǎng)了小鼠的生存周期。同時(shí)，Hhep定殖對(duì)腫瘤小鼠的腸道微生物群產(chǎn)生影響，以及腫瘤的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)增加。以上結(jié)果表明，Hhep定殖介導(dǎo)了結(jié)腸癌中強(qiáng)大的抗腫瘤作用。
2. Hhep驅(qū)動(dòng)的抗腫瘤免疫
為了更全面的了解Hhep定殖對(duì)CRC TME的影響，作者對(duì)腫瘤上皮層細(xì)胞（epithelial layer,EL）進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共鑒定出12個(gè)細(xì)胞簇，Hhep定殖誘導(dǎo)了細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（簇1）和效應(yīng)T細(xì)胞（簇5）的增加。其中細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞包含多種不同的NK細(xì)胞和T細(xì)胞（CD8⁺、CD4⁺），表達(dá)與細(xì)胞毒性功能相關(guān)的基因（Gzma）。以上數(shù)據(jù)表明，Hhep定殖增加細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)。
3. Hhep定殖促使TLSs擴(kuò)張
前人的研究表明，Hhep特異性CD4⁺T細(xì)胞主要在結(jié)腸固有層（ lamina propria,LP）中積累（Chai et al., 2017; Xu et al., 2018），因此作者利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析了Hhep定殖對(duì)LP的影響。聚類分析揭示了表達(dá)與基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因的細(xì)胞（簇 1、5、9 和 13）的富集，特別是 Hhep 定殖小鼠中 Ccl21a⁺Lyve1⁺ 淋巴管簇（簇 9、子簇 2）的增加。同時(shí)，作者觀察到 LP 中淋巴管生成所需基因（Pdpn，Vegfc）的頻率增加，熒光顯微鏡顯示 Lyve-1 染色增加。Hhep定殖的小鼠顯示腫瘤周?chē)�和腫瘤內(nèi)部的TLSs數(shù)量增加，與TLS形成相關(guān)的基因表達(dá)增加，以上數(shù)據(jù)表明，Hhep 定殖促使小鼠結(jié)腸淋巴網(wǎng)絡(luò)的擴(kuò)張。
4. Hhep定殖驅(qū)動(dòng)Hhep特異性CD4⁺Tfh細(xì)胞擴(kuò)增
抗體介導(dǎo)的耗竭實(shí)驗(yàn)顯示，抗腫瘤免疫不依賴于CD8⁺T細(xì)胞，但依賴于CD4⁺T細(xì)胞。因此，作者分析了結(jié)腸中CD4⁺T細(xì)胞對(duì)Hhep定殖的反應(yīng)，流式結(jié)果顯示，在Hhep定殖后，CD4⁺ T細(xì)胞中Tfh細(xì)胞（CXCR5⁺PD1⁺CD4⁺ T cells）的百分比持續(xù)增加，即在結(jié)直腸腫瘤的背景下，Hhep定殖驅(qū)動(dòng)Hhep特異性Tfh細(xì)胞擴(kuò)增。
5. Tfh細(xì)胞是Hhep菌介導(dǎo)的腫瘤控制和免疫浸潤(rùn)所必需的
對(duì)TLSs進(jìn)行FISH染色發(fā)現(xiàn)TLSs中含有Hhep菌和Hhep特異性T細(xì)胞。為了測(cè)試Hhep特異性Tfh細(xì)胞在TLS誘導(dǎo)和直接控制CRC中的重要性，作者利用AOM-DSS+Hhep處理Bcl6^fl/flCd4^Cre小鼠（Tfh 細(xì)胞缺陷型）誘導(dǎo)CRC證實(shí)了Tfh細(xì)胞是Hhep驅(qū)動(dòng)的結(jié)腸TLS形成、腫瘤的免疫浸潤(rùn)和控制腫瘤生長(zhǎng)所必需的。所有數(shù)據(jù)表明，在CRC動(dòng)物模型中，Hhep特異性Tfh細(xì)胞足以驅(qū)動(dòng)TLS形成、增加免疫浸潤(rùn)并導(dǎo)致腫瘤減少或清除。癌癥基因組圖譜 (TCGA) 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)CRC患者的分析表明，豐富的Tfh細(xì)胞特征通常存在于處于較低腫瘤階段的患者體內(nèi)，并且還與更長(zhǎng)的無(wú)進(jìn)展生存期相關(guān)，因此，在小鼠和人類患者中，Tfh細(xì)胞和TLS的存在與更好地控制CRC相關(guān)。