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組學(xué)大牛Matthias Mann利用DIA蛋白組發(fā)現(xiàn)急性髓系白血病治療新靶標(biāo)

瀏覽次數(shù)：1171　發(fā)布日期：2022-4-29　來(lái)源：中科新生命

染色體易位（8;21）是急性髓系白血病(AML)中最常見(jiàn)的遺傳病變之一，重排后 AML1的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄抑制因子ETO融合，導(dǎo)致AML1-ETO（AE）融合轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。AE抑制正常AML1功能的轉(zhuǎn)錄活性，阻斷其分化并促進(jìn)了自我更新。常規(guī)化療是AE陽(yáng)性AML主要治療方式，但常規(guī)化療不能治愈，且大量患者容易復(fù)發(fā)。迄今為止，尚未找到針對(duì)白血病融合蛋白AML1-ETO藥物靶點(diǎn)。

2022年2月德國(guó)格拉夫瓦爾德大學(xué)的Florian H. Heidel和和馬克斯·普朗克生物化學(xué)研究所Matthias Mann等團(tuán)隊(duì)合作在Blood(IF 22.1)雜志上發(fā)表題為“PLCG1 is required for AML1-ETO leukemia stem cell self-renewal”的研究成果，利用DIA蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)由致癌融合蛋白AE驅(qū)動(dòng)AML中磷脂酶C（PLC）信號(hào)通路發(fā)生變化，PLC家族中的PLC-gamma-1（PLCG1）鑒定為AE融合蛋白的特定靶標(biāo)，確定PLCG1途徑是AML1-ETO 白血病的重要治療靶點(diǎn)。

研究材料
小鼠造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞、AE陽(yáng)性/陰性白血病患者CD34+細(xì)胞、AE-陽(yáng)性SKNO1細(xì)胞、AE-陽(yáng)性 Kasumi-1細(xì)胞

技術(shù)路線
· 步驟1：DIA蛋白組學(xué)分析小鼠AML1-ETO(AE)與MLL-AF9(MA9)誘導(dǎo)的AML白血病干細(xì)胞，確定差異蛋白；
· 步驟2：AE陽(yáng)性/陰性白血病患者CD34+細(xì)胞蛋白組學(xué)驗(yàn)證差異蛋白變化情況；
· 步驟3：檢測(cè)AML-1及轉(zhuǎn)錄因子與差異蛋白啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合；
· 步驟4：檢測(cè)差異蛋白對(duì)細(xì)胞功能的影響。

研究結(jié)果
1. 磷脂酶C信號(hào)在AML1-ETO LSCs中富集
首先，研究人員用表達(dá)AE或MLL-AF9的原代小鼠白血病干細(xì)胞進(jìn)行了DIA蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共定量到3000多個(gè)蛋白，差異蛋白868個(gè)，功能分析發(fā)現(xiàn)磷脂酶C（PLC）通路和鈣依賴(lài)性細(xì)胞信號(hào)通路顯著上調(diào)。這一結(jié)果在原發(fā)性患者CD34+樣本的蛋白組學(xué)分析中得到進(jìn)一步證實(shí)。與文獻(xiàn)已報(bào)道數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，發(fā)現(xiàn)在PLC家族中，只有PLCG1表達(dá)量在AE-AML中顯著升高，而且PLCG1在復(fù)發(fā)患者中表達(dá)量也是顯著升高。

圖1 PLC和Ca²⁺信號(hào)在AML1-ETO轉(zhuǎn)化的LSCs中富集

2. PLCG1是AML1-ETO的靶點(diǎn)
為了闡明AE-AML中PLCG1的高表達(dá)是否由AML1-ETO誘導(dǎo)，研究人員分析了AE-陽(yáng)性SKNO1細(xì)胞、非AE細(xì)胞系(K562)和正常人CD34+細(xì)胞的AML1-染色質(zhì)免疫共沉淀數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)只在AE-陽(yáng)性SKNO1細(xì)胞的PLCG1啟動(dòng)子區(qū)域檢測(cè)到與AML1特異性結(jié)合。AML1-ETO與不同的轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同維持白血病細(xì)胞中PLGC1的高水平表達(dá)。研究人員進(jìn)一步用多西環(huán)素(Dox)誘導(dǎo)的AML1-ETO人胚胎干細(xì)胞分化模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)PLCG1的表達(dá)與Dox同步且呈現(xiàn)Dox劑量依賴(lài)性。

圖2 PLCG1是AML1-ETO的靶點(diǎn)

3. AML1-ETO與非編碼元件的結(jié)合對(duì)PLCG1的表達(dá)至關(guān)重要
Chi-C實(shí)驗(yàn)確定了幾個(gè)與PLCG1啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的基因組區(qū)域，為更一步驗(yàn)證這些區(qū)域在AML1-ETO中的作用，研究人員采用CRISPR/Cas9技術(shù)，在AE-陽(yáng)性 Kasumi-1和 SKNO-1細(xì)胞中，敲除PLCG1啟動(dòng)子-128kb區(qū)域的與AE結(jié)合的500bp基因片段，發(fā)現(xiàn)PLCG1的mRNA表達(dá)量下降。進(jìn)一步添加抑制劑阻止RNA聚合酶II招募于增強(qiáng)子區(qū)域，也發(fā)現(xiàn)PLCG1的表達(dá)量顯著降低。最后，研究人員采用CRISPR/ cas9敲除白血病活性所必須的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子JUN、FOS和CREB的缺失將導(dǎo)致PLCG1 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著降低，ChIP-seq實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)AML1-ETO的缺失導(dǎo)致JUN與PLCG1啟動(dòng)子的結(jié)合減少。以上結(jié)果說(shuō)明，AML1-ETO與信號(hào)響應(yīng)因子AP-1和CREB是AE細(xì)胞中PLCG1高表達(dá)所必須的。

圖3 AML1-ETO結(jié)合非編碼元件影響PLCG1的表達(dá)

4. AML1-ETO誘導(dǎo)的細(xì)胞功能依賴(lài)于PLCG1
為評(píng)估PLCG1的功能重要性，研究人員在skno1細(xì)胞、Kasumi-1細(xì)胞中分別采用CRISPR/ cas9技術(shù)對(duì)PLCG1基因敲除或用RNAi對(duì)PLCG1基因敲低，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力下降，且PLCG1的基因失活導(dǎo)致誘導(dǎo)分化的骨髓標(biāo)記物如CD13和CD14的表達(dá)增加。研究人員進(jìn)一步對(duì)PLCG1缺失Kasumi-1細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)與骨髓分化相關(guān)的基因上調(diào)，與增殖、干細(xì)胞干性和c-Myc靶標(biāo)相關(guān)的基因下調(diào)，此外，被AML1-ETO抑制的基因在PLCG1敲低后顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明，PLCG1缺失逆轉(zhuǎn)了人類(lèi)AML細(xì)胞中AML1-ETO融合引發(fā)的基因表達(dá)變化。

圖4 AML1-ETO誘導(dǎo)的細(xì)胞功能依賴(lài)于PLCG1

5. AML1-ETO轉(zhuǎn)化細(xì)胞依賴(lài)于PLCG1
為了解PLCG1在AE白血病干細(xì)胞（AE-LSCs）中的作用，研究人員選用與臨床相關(guān)且侵襲表型更強(qiáng)的AML1-ETO9a (AE)和突變RAS (KRASG12D;K)(表示為AE/K)小鼠，建立了條件敲除小鼠模型。逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)導(dǎo)致Plcg1基因缺失，AE/K-LSCs (GFP+ LSK)細(xì)胞數(shù)目減少，并且AE誘導(dǎo)的體外無(wú)限增殖能力喪失。AE/K-LSCs中PLCG1的基因缺失也會(huì)損害次級(jí)受體宿主的白血病發(fā)展，然而在MLL-AF9 (MA9)轉(zhuǎn)化的白血病干細(xì)胞中PLCG1的基因缺失對(duì)干細(xì)胞數(shù)目和再次接種能力無(wú)影響。以上結(jié)果說(shuō)明，AML1-ETO轉(zhuǎn)化的白血病干細(xì)胞生長(zhǎng)依賴(lài)于PLCG1。

圖5 AML1-ETO轉(zhuǎn)化的造血干細(xì)胞依賴(lài)于PLCG1

6. PLCG1是維持AML1-ETO白血病干細(xì)胞所必需的
為了在體內(nèi)證實(shí)以上推測(cè)，研究人員將亞致死劑量的AE/ k轉(zhuǎn)化的Plcg1F/F Mx-Cre+和Plcg1+/+ Mx-Cre+白血病干細(xì)胞注射到受體宿主中，并在移植后的連續(xù)時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在注射pIpC誘導(dǎo)crec之前，兩組白血病干細(xì)胞具有相似定植能力。注射pIpC后，每個(gè)受體小鼠的AE/K Plcg1+/+細(xì)胞總數(shù)增加，直到發(fā)生明顯致命的白血病。Plcg1缺失導(dǎo)致受體宿主白血病發(fā)育喪失，白血病干細(xì)胞在外周血中數(shù)目下降，白血病干細(xì)胞出現(xiàn)分化誘導(dǎo)，細(xì)胞周期喪失，而對(duì)正常的造血干細(xì)胞無(wú)影響。連續(xù)注射5-氟尿嘧啶恢復(fù)造血功能，進(jìn)一步證實(shí)只有AE驅(qū)動(dòng)的AML白血病干細(xì)胞依賴(lài)于PLCG1維持自我更新能力。

圖6 PLCG1維持白血病干細(xì)胞的功能

7. Ca²⁺信號(hào)的藥理學(xué)干擾抑制AML1-ETO白血病干細(xì)胞的功能
到目前為止，還沒(méi)有針對(duì)PLCG1的特異性抑制劑。為了評(píng)估AE轉(zhuǎn)化細(xì)胞中依賴(lài)PLCG1的相關(guān)細(xì)胞功能，研究人員進(jìn)行了深入的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)PLCG1缺失后412個(gè)蛋白顯著下調(diào)。GSEA分析發(fā)現(xiàn)PLCG1缺失后，下游Ca²⁺-信號(hào)通路變化極明顯。研究人員添加鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑環(huán)孢素A（CsA）后，發(fā)現(xiàn)AE陽(yáng)性細(xì)胞增殖能力顯著降低，AE陽(yáng)性白血病小鼠體內(nèi)白血病癥狀減輕，導(dǎo)致二次受體宿主的疾病發(fā)病延遲，生存期延長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)AE陰性的MA9白血病小鼠無(wú)影響。此外CsA處理后，白血病干細(xì)胞數(shù)目減少，原代AE陽(yáng)性AML細(xì)胞集落減少，而在正常造血干細(xì)胞中無(wú)影響。說(shuō)明，靶向Ca²⁺-信號(hào)的藥物CsA，可以干擾AE驅(qū)動(dòng)的白血病干細(xì)胞，進(jìn)而影響AE-AML的發(fā)展與維持。

圖7 Ca²⁺-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響AML1-ETO白血病干細(xì)胞的體內(nèi)外功能

小編小結(jié)
本研究通過(guò)蛋白組學(xué)技術(shù)深入解析AML1-ETO型白血病的發(fā)病機(jī)理，發(fā)現(xiàn)PLCG1蛋白表達(dá)顯著變化。后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)在小鼠和人AML中PLCG1的基因失活抑制了AML1-ETO依賴(lài)的自我更新程序、白血病增殖和體內(nèi)白血病維持。這些結(jié)果表明PLCG1通路可作為AML1-ETO陽(yáng)性白血病干細(xì)胞的一個(gè)重要治療靶標(biāo)。本研究為白血病臨床治療指出了新的方向。

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