Gut文獻(xiàn)：角鯊烯環(huán)氧酶通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖和腸道菌群失調(diào)加速CRC進(jìn)展

結(jié)直腸癌（CRC）是第三大最常見的癌癥，全球癌癥死亡率第二。晚期CRC轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后較差，耐藥性嚴(yán)重。因此，尋找與CRC發(fā)病機(jī)制相關(guān)的新基因?qū)﹂_發(fā)有效的CRC治療方法至關(guān)重要。越來(lái)越多的研究表明，脂質(zhì)代謝異常是CRC等癌癥的標(biāo)志性特征，然而，參與CRC脂質(zhì)代謝依賴的分子機(jī)制仍知之甚少。角鯊烯環(huán)氧化酶(Squalene epoxidase, SQLE)是膽固醇生物合成中的限速酶，有研究表明SQLE在CRC中過(guò)表達(dá)，但SQLE在CRC進(jìn)展中的潛在作用仍存在爭(zhēng)議。香港中文大學(xué)的于君研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)配對(duì)的CRC和癌旁組織樣本采用mRNA和蛋白表達(dá)分析，SQLE轉(zhuǎn)基因（Sqle tg）小鼠糞便樣本進(jìn)行宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)分析共同揭示了SQLE在CRC中的作用，相關(guān)研究成果發(fā)表于《Gut》。

1. SQLE在CRC中過(guò)表達(dá)且與CRC預(yù)后不良相關(guān)

對(duì)三個(gè)獨(dú)立的CRC隊(duì)列（香港隊(duì)列、TCGA 和 GDS4382）中SQLE的mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性CRC組織中SQLE的 mRNA和蛋白的表達(dá)均高于對(duì)照癌旁組織。使用Kaplan-Meier曲線和多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析評(píng)估SQLE對(duì)CRC患者預(yù)后的影響，結(jié)果顯示SQLE mRNA的高表達(dá)與CRC患者差的預(yù)后相關(guān)，是CRC疾病特異性預(yù)后不良的獨(dú)立因素。進(jìn)一步借助免疫組化對(duì)207例CRC患者進(jìn)行TMA分析也證實(shí)了SQLE能在蛋白水平上預(yù)測(cè)患者的預(yù)后（圖1）。可見SQLE mRNA和蛋白表達(dá)是預(yù)測(cè)CRC患者生存不良的獨(dú)立預(yù)后因素。

 

圖1. SQLE在CRC中表達(dá)上調(diào)預(yù)示著較差的生存

 

2. SQLE過(guò)表達(dá)促進(jìn)CRC發(fā)生

在體外細(xì)胞水平上證實(shí)了SQLE通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和激活細(xì)胞周期進(jìn)程來(lái)促進(jìn)CRC細(xì)胞生長(zhǎng)后，進(jìn)一步在體內(nèi)動(dòng)物水平上以Rosa26-Sqle tg小鼠與Cdx2-Cre^ERT2小鼠雜交構(gòu)建結(jié)腸特異性Sqle tg小鼠來(lái)探究SQLE在體內(nèi)CRC發(fā)生中的相關(guān)性。與野生型小鼠相比，Sqle tg小鼠的腫瘤發(fā)生率、腫瘤數(shù)量和腫瘤負(fù)荷均顯著增加，Sqle tg結(jié)腸內(nèi)CRC形成，伴有結(jié)腸異型增生和高度異型增生的小鼠比例增加。同時(shí)Sqle tg小鼠在CRC中的致癌功能可以通過(guò)細(xì)胞增殖增加的Ki-67評(píng)分和細(xì)胞凋亡減少的TUNEL評(píng)分來(lái)證明。通過(guò)對(duì)小鼠的結(jié)腸組織進(jìn)行癌癥通路PCR分析，觀察到細(xì)胞增殖標(biāo)志物Mki67、Ccnd2和E2f4表達(dá)上調(diào)，而促凋亡基因Casp9和Casp2表達(dá)下調(diào)，從而證明Sqle在CRC腫瘤發(fā)生中促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的作用。在CRISPR/Cas9的全身Sqle KO小鼠上構(gòu)建AOM-DSS化學(xué)致癌模型，與野生型相比，Sqle KO小鼠結(jié)腸腫瘤數(shù)量減少，再次證明Sqle在體內(nèi)結(jié)直腸腫瘤發(fā)生中的致癌功能（圖2）。

圖2. 結(jié)腸特異性Sqle tg小鼠促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤發(fā)生

 

3. SQLE促進(jìn)膽固醇從頭生物合成

SQLE是膽固醇生物合成的第二限速酶，在LOVO和SW1116細(xì)胞中，SQLE過(guò)表達(dá)增加了膽固醇生物合成基因（HMGCS1、HMGCR、MVK、PMVK、MVD、IDI1、FDPS和FDFT1）的mRNA表達(dá)，蛋白印跡分析發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SQLE的細(xì)胞或Sqle tg小鼠的 HMGCR、FDFT1和FDPS 蛋白水平升高，而 SQLE敲低或Sqle^+/−小鼠相應(yīng)基因的蛋白水平下調(diào)，提示SQLE能促進(jìn)膽固醇從頭生物合成，進(jìn)而促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖（圖3，圖4）。

圖3. SQLE過(guò)表達(dá)促進(jìn)膽固醇生物合成基因表達(dá)

圖4. SQLE敲低抑制膽固醇合成途徑基因表達(dá)

 

4．Sqle tg小鼠腸道菌群失調(diào)及代謝組改變

腸道菌群失調(diào)是CRC發(fā)生的新致病因素，作者對(duì)Sqle tg和野生型小鼠糞便進(jìn)行鳥槍宏基因組分析，Sqle tg小鼠的α多樣性指數(shù)呈下降趨勢(shì)，并測(cè)定Sqle tg和野生型小鼠的細(xì)菌組成變化，觀察到Sqle tg小鼠中Desulfovibrio fairfieldensis, Rhodococcus erythropolis, Brucella abortus和Chlamydia muridarum等致病菌顯著富集，而保護(hù)性細(xì)菌如Streptomyces violaceusniger和Pseudomonas sp Leaf58減少，經(jīng)qPCR驗(yàn)證這些關(guān)鍵菌種類的變化，表明體內(nèi)SQLE過(guò)表達(dá)促進(jìn)腸道菌群失調(diào)。

已知富集的致病菌具有多種代謝活性，對(duì)小鼠糞便進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，結(jié)果與野生型小鼠相比，Sqle tg小鼠糞便富含次級(jí)膽汁酸如石膽酸、鵝去氧膽酸、�；侨パ跄懰�、去氧膽酸，并經(jīng)靶向代謝組學(xué)證實(shí)Sqle tg小鼠次級(jí)膽汁酸如石膽酸、異石膽酸、異別石膽酸和去氧膽酸的升高。次級(jí)膽汁酸是在腸道菌群的作用下由初級(jí)膽汁酸轉(zhuǎn)化生成的，對(duì)Sqle tg小鼠腸道菌群和代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)次級(jí)膽汁酸和致病菌C. muridarum顯著相關(guān)，提示C. muridarum可能參與促進(jìn)次級(jí)膽汁酸的增加。此外，發(fā)現(xiàn)四種病原菌均與代謝物改變呈正相關(guān)，表明Sqle tg表達(dá)在小鼠CRC進(jìn)展中調(diào)節(jié)腸道微生物組和代謝物（圖5）。

圖5. 結(jié)腸特異性Sqle tg小鼠腸道菌群和代謝物改變

 

5．SQLE過(guò)表達(dá)損害腸道屏障功能

次級(jí)膽汁酸作為一種內(nèi)毒素，其水平升高是CRC的重要風(fēng)險(xiǎn)因素，它對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞有毒性，破壞腸道屏障功能，而腸道菌群失調(diào)也與腸道屏障受損密切相關(guān)，因此，SQLE過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致腸屏障功能障礙。通過(guò)對(duì)Sqle tg和野生型小鼠腸道屏障功能進(jìn)行FITC-葡聚糖跨上皮通透性分析，發(fā)現(xiàn)Sqle tg小鼠血清FITC-葡聚糖水平更高，電子顯微鏡（EM）也觀察到Sqle tg小鼠緊密連接的破壞。上皮緊密連接是由細(xì)胞連接蛋白維持的，蛋白質(zhì)印跡分析發(fā)現(xiàn)Sqle tg小鼠結(jié)腸中的細(xì)胞連接蛋白Jam-c和occludin下調(diào)。此外，Sqle tg小鼠內(nèi)粘液關(guān)鍵成分MUC2的mRNA水平也下調(diào)。腸漏誘導(dǎo)促炎反應(yīng)，Sqle tg小鼠結(jié)腸組織炎癥通路的PCR陣列分析顯示CxCl3、CRP和CXCR2等促炎因子顯著上調(diào)。綜上，腸道菌群失調(diào)-代謝物軸可能導(dǎo)致 Sqle tg小鼠腸道屏障功能障礙。

進(jìn)一步收集AOM模型的Sqle tg和野生型小鼠的糞便移植到無(wú)菌(GF)小鼠體內(nèi)，以探究Sqle tg表達(dá)誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)是否能影響結(jié)腸細(xì)胞增殖。在處死小鼠前進(jìn)行FITC葡聚糖跨上皮通透性分析，發(fā)現(xiàn)Sqle tg小鼠糞便進(jìn)行灌胃的GF小鼠血清中FITC-葡聚糖水平高于野生型小鼠糞便灌胃的GF小鼠，并經(jīng)EM 證實(shí)腸道屏障破壞。同理與移植野生型糞便相比，移植Sqle tg小鼠糞便的GF小鼠細(xì)胞連接蛋白Jam-c和occludin表達(dá)下調(diào)，同時(shí)Ki-67染色表明其顯著促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖。總之，SQLE誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)使腸道屏障功能受損進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞生長(zhǎng)（圖6）。

圖6. 腸道菌群-代謝物軸介導(dǎo)Sqle tg FMT小鼠腸屏障功能障礙

 

6. 藥物抑制SQLE提高CRC的化療效果

使用SQLE抑制劑特比奈芬處理HT29和DLD1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)特比奈芬在體外劑量依賴性抑制HT29和DLD1細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，特比奈芬也顯著抑制原發(fā)性CRC類器官的生長(zhǎng)。接著評(píng)估CRC常用化療藥特比奈芬與奧沙利鉑或5-FU聯(lián)合用藥效果，發(fā)現(xiàn)特比奈芬使HT29和DLD1細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑和5-FU的生長(zhǎng)抑制更敏感，聯(lián)合指數(shù)(CI)定量評(píng)估表明特比奈芬與奧沙利鉑或5-FU的聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用，在體外協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步建立裸鼠皮下移植瘤模型，將1106個(gè)HT29細(xì)胞植入裸鼠背側(cè)，分為六組：（1）載體；(2)特比萘芬；(3) 5-FU；(4) 奧沙利鉑；(5) 特比萘芬+5-FU 和(6) 特比萘芬+奧沙利鉑。結(jié)果表明，單藥治療可抑制約50%的腫瘤生長(zhǎng)，且與載體相比，特比奈芬+5-FU和特比奈芬+奧沙利鉑用藥均可使腫瘤完全停止生長(zhǎng)，效果明顯優(yōu)于單藥治療。在CRC治療中SQLE可作為治療靶點(diǎn)，抑制SQLE可以提高CRC化療效果。

 

圖7. SQLE是CRC的治療靶點(diǎn)

 

小結(jié)

本研究通過(guò)細(xì)胞系、結(jié)腸特異性Sqle tg小鼠和Sqle KO小鼠模型建立了SQLE作為CRC的致瘤因子，明確了SQLE在CRC中的致癌作用，SQLE可以促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖和存活，并通過(guò)引起腸道菌群失調(diào)、代謝物改變、腸屏障功能障礙進(jìn)而影響腸道腫瘤微環(huán)境。特比萘芬對(duì)SQLE的阻斷作用對(duì)CRC細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，因此特比奈芬聯(lián)合5-FU或奧沙利鉑可以顯著提高治療效果，提示其在CRC治療中的臨床應(yīng)用潛力。

 

參考文獻(xiàn)

Squalene epoxidase drives cancer cell proliferation and promotes gut dysbiosis to accelerate colorectal carcinogenesis. Gut. 2022. 

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