Neuron文章：Inscopix鈣成像顯微鏡研究小鼠嗅覺刺激對空間記憶的增強

美國哥倫比亞大學的Richard Axel課題組于2021年10月27日在Neuron上發(fā)表了題為“Olfactory landmarks and path integration converge to form a cognitive spatial map”的文章，在這項研究中，Fischler-Ruiz等人展示了當小鼠利用氣味線索在黑暗中導航時，海馬神經元的活動是如何通過感覺特征識別出位置信息的。他們通過使用Inscopix自由活動鈣成像顯微鏡記錄海馬CA1的神經活動，發(fā)現路徑整合對氣味線索施加了空間意義，從而創(chuàng)造了新的位置標記，極大提高了導航能力，并且同一氣味出現在不同的位置是也產生了不同的位置細胞（Place Cell）的表征。



摘要

內部路徑整合和外部感覺標志的融合在海馬體中生成認知空間圖。在一個虛擬導航任務中，作者使用Inscopix鈣成像顯微鏡記錄了CA1細胞的活動，來研究小鼠如何表現、識別和使用局部的嗅覺氣味線索來估計自己的位置。作者觀察到在虛擬環(huán)境中的多個位置存在氣味線索極大地豐富了位置細胞的表征，并改善了導航。在不同位置呈現相同的氣味會產生不同的位置細胞表示。近端位置的氣味線索增強了局部位置細胞密度，也導致位置細胞超出提示的形成。這導致將第二個更遠的氣味線索識別為獨特的地標，這表明將空間表征擴展到未知領域的迭代機制。這項研究結果表明，氣味可以作為位置標志，并啟動路徑整合和氣味線索依次迭代的相互作用模型，從而形成長距離的認知空間地圖。

正文

路徑整合是一種導航策略，允許動物形成相對于外部路標的內部位置估計。路徑整合依賴于來自前庭、本體感受、視覺流和運動源的腦(自主運動)信號，這些信號提供了對運動的不完美估計。內部位置估計中的累積誤差必須通過外部路標加以糾正。路徑整合和外部地標的匯合擴大了動物精確導航的范圍。

地標的識別提出了一個有趣的概念問題。地標的感官特征沒有內在的空間意義，只有在空間中被認定為固定的時候才有價值，而這一確定可能需要路徑整合。如果在不同的位置遇到相同的感覺特征，則會出現進一步的消歧問題。路徑整合和感官特征的融合創(chuàng)造了一個認知空間地圖，可以在這些特征上施加獨特的空間意義，從而創(chuàng)建地標。

氣味是感官信息的主要來源，如果固定在空間中，氣味可以作為導航路標。海馬接受來自外側內嗅皮層(LEC)的嗅覺信息。LEC接受來自嗅球和梨狀皮層的直接輸入，這兩個結構負責編碼氣味身份。氣味對海馬活動的影響已經在空間和非空間環(huán)境中被觀察到。內側內嗅皮層(MEC)的網格、頭部方向和速度細胞受內部路徑整合信號驅動，向海馬提供位置和自我運動信息。在黑暗中，這些內部路徑整合信號，結合嗅覺和/或觸覺線索，能夠支持海馬體中穩(wěn)定的空間表征。因此，海馬體是內部路徑整合和外部感覺標志的潛在匯聚點。

作者檢測了小鼠海馬神經元的活動，在執(zhí)行導航行為時，依賴路徑整合和稀疏的嗅覺感官線索。這些實驗結果表明，路徑整合和路標在海馬體認知空間地圖的形成過程中具有收斂性。這些觀察導致了一個理論模型的形成，以描述路徑整合和嗅覺地標如何在一個迭代過程中相互作用，形成一個認知空間地圖。

1存在于嗅覺標志下的精確導航行為

作者設計了一系列實驗，讓小鼠在黑暗中基于路徑整合結合嗅覺地標導航到一個虛擬的目標位置。開始，訓練頭部固定的小鼠在一個球形跑步機上行走4米，在完全黑暗中到達一個沒有標記的目標位置，并獲得飲水獎勵(圖1A)。這項任務要求小鼠使用基于內部獨特信號的路徑整合來估計自己和目標的位置。在沒有氣味的情況下，行為表現在1-2周后趨于穩(wěn)定(n = 5只小鼠)。小鼠在沿4米軌道移動約2米后就開始舔舐，并降低了奔跑速度(圖1B、1C、1D)。因此，在這個實驗中，依靠路徑整合是不可能精確測量大于2米的距離。

接下來，在小鼠到達1米和3米的位置時，作者引入了兩次短暫的相同氣味脈沖(圖1E)。光離子檢測器(PID)的測量結果顯示，1-m和3-m脈沖產生的氣味濃度只有1%的差異(圖1F)。實驗使用兩種中性氣味，檸檬烯或蒎烯，進行隨機交叉實驗。經過四天的氣味提示訓練后，所有的小鼠都抑制了舔舐，并保持了3.5米的高速奔跑后，才開始舔舐，并在距離獎勵地點0.5米的地方迅速減慢了它們的奔跑速度(圖1C、1D、1G)。這表明，小鼠將氣味識別為空間地標，并利用這些地標來改善導航。

圖1 存在于嗅覺標志下的精確導航行為

2 嗅覺標志增強了CA1中的位置細胞的活動水平

作者使用微型顯微鏡(nVista, Inscopix)和遺傳編碼的熒光Ca2+指示劑GCamp6f在每個實驗中對~ 3000個CA1錐體神經元進行成像采集。使用Inscopix Data Processing Software(IDPS)識別單個神經元和它們的Ca2+跡線，并將它們的活動記錄到虛擬軌道上小鼠的軌跡上。神經和行為數據在行為窗口100毫米的中取平均值進行分析。具有一致位置選擇活動的神經元被分類為位置細胞。
 

圖2 嗅覺標志增強了CA1中的位置細胞的活動水平

在1-2周沒有氣味線索的訓練后，5.8%的成像神經元被歸類為位置細胞(2893個神經元中的169個;圖2 A-2C)。位置細胞的空間密度在起始位置比較大，并隨距離迅速衰減(長度常數±引導標準誤差:0.97±0.20 m;圖2D)。位置場的可靠性隨著離起始位置的距離的增加而降低，而位置場的抖動和寬度則隨著小鼠穿過軌跡的增加而增加(圖2E)。在種群水平上，種群活動載體的跨試驗穩(wěn)定性隨距離的增加而降低(0.44±0.02 vs 0.23±0.01;圖2F)。這些結果表明，在這種模式下，靠路徑整合無法支持超過~2 m的位置細胞活性。~2 m以上空間的神經表征稀疏且不可靠，與小鼠在~2 m開始舔舐的行為觀察相一致，可能反映了路徑整合中的錯誤積累。

接下來，作者研究了空間定位氣味線索是否會增強位置細胞的表征。小鼠在1米和3米的氣味提示下連續(xù)4天完成該任務后，位置細胞的百分比從5.8%增加到35%(2778個神經元中有979個是檸檬烯和蒎烯結合的位置細胞;圖2G-2I)。位置細胞的密度隨著軌跡長度的增加而增加，但在1 m和3 m之后明顯，氣味呈現的位置肯定(圖2D)。重要的是，盡管在這兩個地方暴露于相同的氣味，不同組的位置細胞在1m和3m處仍然活躍。作者還觀察到在氣味呈現的兩個部位都有反應的神經元相對較少(圖2J；2.4%， 2778個神經元中有68個)。三個間隔峰的存在(在起始點和兩個氣味點)使得位置細胞密度在整個軌跡上保持高水平，盡管峰之間存在衰減。氣味訓練后，位置場的可靠性增加，而位置場抖動有降低的趨勢(圖2E)。在種群水平上，氣味訓練后種群活動載體的跨試驗穩(wěn)定性增加(0.36±0.01 vs 0.61±0.01;圖2F)。位置細胞密度的增加和可靠性的提高與動物在氣味提示時抑制舔舐和保持跑向獎賞區(qū)域的能力是一致的。位置細胞在3米氣味線索處的峰值和上升的位置細胞密度一直到獎勵位置，這與使用認知空間地圖來支持導航是一致的。

對單個試驗的位置細胞活性分析顯示，在1-m和3-m氣味線索處活躍的位置細胞數量之間存在相關性(圖2K)。這表明在空間導航過程中，近地標位置細胞的密度會影響遠地標位置細胞的密度。

在對CA1種群活動的位置進行解碼后，作者觀察到，小鼠在很大程度上調整了距離估計和舔舐行為，以響應一次又一次的速度偏差，顯示出CA1神經活動和導航行為之間的聯(lián)系。重要的是，這表明，動物在執(zhí)行任務時使用路徑整合，將氣味線索識別為空間地標，而不是使用經過時間的估計。綜上所述，這些結果表明氣味線索可以作為路標，與路徑整合結合，產生強大的空間依賴神經活動，支持準確的導航行為。

3 嗅覺標志誘導位置細胞重新定位，產生不同的認知空間地圖

通過檸檬烯和蒎烯的交錯實驗，研究了不同的氣味是否會引起不同的空間圖。這兩種氣味產生了不同的位置細胞表示，顯示了重新映射(圖3A)。在檸檬烯和蒎烯實驗中，除了位置1的氣味線索(1米)，只有11%的位置細胞(708個位置細胞中的78個)在相同的位置興奮。根據這些發(fā)現，在位置1個氣味線索之后，群體活動的試驗平均向量之間的相關性從相同氣味的80%下降到不同氣味的15%，并且在1 m以上仍然很小(圖3B)。檸檬烯和蒎烯試驗之間的重新映射早在訓練的1天就被觀察到在氣味線索的存在(圖3C)。這些數據表明，在相同的任務中，相同位置的不同氣味會產生不同的認知空間地圖。
 

圖3 嗅覺標志誘導位置細胞重新定位，產生不同的認知空間地圖

4 位置細胞圖的逐漸和連續(xù)出現以及導航行為的改進

作者進一步分析了路徑整合和氣味線索的相互作用，考察了位置細胞在訓練過程中的出現和導航行為的相關改善。在氣味提示下進行訓練的1天，小鼠開始舔舐并在約2米時降低奔跑速度，而在3米氣味提示開始時短暫抑制舔舐并提高奔跑速度(圖4A和4B)。通過計算舔舐比率來量化預期舔舐行為，定義為獎勵0.3 m內的平均舔舐率除以虛擬軌跡后3 m內的平均舔舐率。在第1天的氣味訓練后，小鼠的舔舐率隨每1天的氣味訓練而增加，可以看到舔舐率從2.74±0.18增加到7.14±0.20(圖4D)。這些觀察結果表明，小鼠利用路徑整合來優(yōu)化它們的導航行為。位置細胞標記的演變反映了導航行為的逐步改進。在隨后的訓練中，位置細胞的數量和密度逐漸增加(圖4F, 4G)。相應的，解碼后的位置估計誤差減小了2倍以上(第1天為0.46 m，第4天為0.22 m;圖4H)。在數天的時間里，隨著更多的位置細胞在1 ~ 3 m的區(qū)域響應，細胞密度在1 m和3 m處的峰值出現是循序漸進的�？臻g地圖擴展的迭代過程中，越來越遠端的感覺線索被識別為地標。這種迭代過程可能是將認知空間地圖擴展到未知領域的基本機制。
 

圖4 位置細胞圖的逐漸和連續(xù)出現以及導航行為的改進

5 CA1中的種群水平活動和狀態(tài)空間軌跡反映了認知空間地圖的逐漸演化

在氣味存在的1天訓練中，作者觀察到群體向量的相關性在x = 1 m之后立即出現一個峰值，這意味著位置2的氣味線索處的群體向量重新對齊到位置1的氣味線索處的狀態(tài)。在氣味訓練過程中，x = 1 m后的相關性明顯減弱。經過氣味訓練后，在第二個氣味線索處的群體反應與在位置1的氣味線索處的反應不相關(圖5A)。這一結果與空間策略一致，而不是基于感官辨別的策略。此外，作者觀察到，在4天的氣味線索訓練過程中，從第1天到第4天，在兩個氣味位置作出反應的神經元數量減少了2倍以上(圖5B, 5C, 5D，和1J；第1天2405個神經元中有137個，占5.7%，，第4天2778個神經元中有68個，占2.4%)。這些數據表明，這兩種氣味線索被逐漸地、順序地識別為空間地標，標志著不同的位置。

采用主成分分析(PCA)來研究小鼠學習任務時神經群體活動的狀態(tài)空間軌跡。經過4天的氣味訓練，二維神經軌跡具有閉環(huán)的形狀，軌跡上的距離與神經軌跡上相應的距離大致成正比(36.5%方差；圖5E)。因此，這種低維神經活動投影的軌跡與任務具有拓撲和測量上的相似性。

在氣味暴露的1天，超過氣味提示的軌跡在3 m處循環(huán)，并沿著與氣味提示1 m處軌跡相似的路徑返回(圖5F)。通過訓練減少了反向循環(huán)，到第四天就沒有了（圖5G和5H）。因此，由1-m和3-m氣味線索引起的群體反應的去相關伴隨著神經軌跡與空間的分離。
 

圖5 CA1中的種群水平活動和狀態(tài)空間軌跡反映了認知空間地圖的逐漸演化

6 去除氣味線索或獎勵位置會改變位置細胞的表征

在沒有氣味提示的情況下，氣味訓練中出現的豐富的位置細胞表征和改善的導航行為是否持續(xù)存在呢？在第5天，經過4天的氣味訓練后，小鼠進行了一個療程，其中蒎烯試驗與無氣味試驗隨機交叉（圖6A）。通過比較，第5天的位置細胞數量比第0天大（圖6B和6C），舔舐行為比第0天更準確（圖6D）。在有氣味提示的第5天試驗中，超過2米的位置細胞數量是沒有氣味的試驗中的2.4倍（3087個神經元中有308個，而3087個神經元中有128個，圖6E和6F）。此外，在沒有氣味提示的第5天試驗中，預期舔舐的準確性較低（圖6G）。

接下來，作者探討了位置細胞活動對獎賞的依賴性。在第6天，小鼠進行了一次沒有給予水獎勵的實驗（圖6H）。在這些條件下，小鼠以相似的速度奔跑，但在4米時不舔也不停（圖6I和6J）。位置細胞的比例從35%降至0.7%（3919個神經元中有29個，檸檬烯試驗18個，蒎烯試驗11個；圖6K）。因此，在這項任務中，魯棒的位置細胞表示取決于獎勵的存在。當獎勵被扣留時，位置細胞的缺失可能反映了獎勵線索提供的空間信息的丟失或任務動機的缺乏。
 

圖6 去除氣味線索或獎勵位置會改變位置細胞的表征

7 在細胞形成過程中路徑整合和氣味線索的收斂模型

氣味線索可以作為導航陸地標記的觀察結果激發(fā)了一個模型來解釋路徑整合和氣味線索的融合如何在海馬體中生成認知空間圖。該模型包括由一組路徑積分器的輸入驅動的位置細胞群，以及從位置細胞返回到路徑積分器的反饋（圖7A）。隨著路徑整合變得不那么可靠，試驗間方差隨著行駛距離的增加而增加（圖7B）。
 

圖7 在細胞形成過程中路徑整合和氣味線索的收斂模型

模型位置細胞通過模擬CA1位置細胞形成期間觀察到的平臺電位效應的過程形成。在此為路徑積分器選擇了一個噪聲水平，以便可靠的位置單元在距離小于2m的地方形成（圖7C）。然后在3米氣味線索的位置重復該過程，形成一個迭代過程，使整個4米軌跡上的完整位置單元表示成為可能（圖7D）。

作者描述的系統(tǒng)由兩個網絡組成：位置細胞和路徑積分器，它們在位置單元細胞時將它們之間的關系的軌跡存儲在它們的突觸中。位置細胞較大限度地由路徑積分器驅動，路徑積分器與位置場形成時發(fā)生的輸入相匹配。該系統(tǒng)通過一個外部事件進行校準，該事件確定這些關系何時一致。這一事件是一個里程碑。

該模型也與實驗觀察結果一致。首先，在模型和氣味訓練后的實驗數據中，不同位置的等效感覺輸入啟動了不同的位置細胞亞群。其次，該模型預測，位置細胞密度和可靠性隨著距離氣味線索的距離而降低，每個線索所在位置的密度和可靠性出現局部峰值（圖7E和7F）。此外，該模型預測，在存在氣味線索的情況下，整個軌跡上位置單元的可靠性將隨著訓練而提高（圖7F和7G）。這兩個模型預測與實驗數據一致（圖2D和2E）。
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該模型提出的空間地圖擴展的迭代機制與在訓練過程中關于位置單元表示的進化的實驗結果是一致的。也就是，氣味可以作為位置標志，激發(fā)路徑整合和氣味線索依次迭代的相互作用模型，從而形成長距離的認知空間地圖。

結論
作者使用Inscopix顯微鏡成像CA1細胞的活動與理論建模相結合，為氣味線索作為位置標記信號的過程提供了有力的證據，在迭代擴展后會形成海馬的認知空間地圖。

參考文獻:

Fischler-Ruiz W, Clark DG, Joshi N, Devi-Chou V, Kitch L, Schnitzer M, Abbott LF, Axel R. Olfactory landmarks and path integration converge to form a cognitive spatial map, Neuron (2021), https://doi.org/10.1016/j.neuron.2021.09.055
 

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