植物組織透明化研究進展綜述

自17世紀中葉胡克用自制的顯微鏡發(fā)現(xiàn)了植物細胞以來，植物科學研究就一直與光學顯微鏡的發(fā)展密切相關(guān)。熒光標記和光學切片的發(fā)展也大大地加快了我們對組織微觀形態(tài)、細胞發(fā)育、蛋白質(zhì)定位和植物-微生物相互作用的研究進程，近年亞細胞級分辨率的3D成像技術(shù)也有助于研究植物的組織結(jié)構(gòu)及其復雜的生理特性。然而，植物細胞本身的光學不透明特性使觀察植物體及其內(nèi)部組織器官受到極大限制，使成像深度被限制在了50μm左右。相比動物，植物還含有一些光敏色素和芳香族化合物，這些成分也容易被激光激發(fā)，從而在成像時產(chǎn)生噪音。組織透明技術(shù)結(jié)合光學成像和圖像處理技術(shù)，能夠?qū)⒄麄�器官或全身快速透明并進行結(jié)構(gòu)和細胞分析，為植物3D成像的發(fā)展提供了一個非常有前景的解決方案，能幫助研究人員在更接近自然的狀態(tài)下觀察植物的內(nèi)部構(gòu)造，有助于農(nóng)作物品種改良、內(nèi)部病蟲害檢測等，對推進植物學科領(lǐng)域的研究進展具有重要意義。（圖1）

圖1. 植物組織透明、三維(3D)成像和數(shù)據(jù)分析流程

時至今日，科學界已經(jīng)涌現(xiàn)出許多先進的透明化技術(shù)，它們各具特色，適合不同領(lǐng)域的研究。植物體由于有細胞壁和葉綠體等特殊組分, 導致光學透明技術(shù)在植物中的應(yīng)用面臨很大挑戰(zhàn)。植物組織不透明的原因主要有兩點：一點是色素對光的吸收，另一點是具有大范圍光折射率的細胞組分造成的光散射。為了達到生物樣本光學透明的目的, 可以采用化學或物理方法去除樣本中的色素和脂類物質(zhì)從而減少樣本對光的吸收和散射,并將樣本浸入指定的匹配液中, 以獲得均勻的內(nèi)部折射率匹配。（圖2）

圖2.植物組織透明化原理

近二十年來，已有大量組織透明技術(shù)被開發(fā)應(yīng)用在了植物組織成像領(lǐng)域。目前常用的植物組織透明方法可以分成基于有機溶劑的透明化方法和基于水性溶劑方法。

1．基于有機溶劑的光學透明技術(shù)

有機溶劑通常具有高脂溶解能力和高折射率(RI=1.5)的特點, 可使處理樣品快速透明化。常見的有機溶劑透明化方法有BABB,3DISCO,uDISCO, vDISCO, PEGASOS等方法。這些方法都需要對樣品先進行脫水，然后再用高折射率的試劑對樣品進行折射匹配，從而實現(xiàn)樣品的組織透明�；�于有機溶劑的透明技術(shù)相對穩(wěn)定, 可用于多種不同類型的組織。然而, 使用的有機溶劑大多具有毒性, 脫水過程中組織收縮嚴重, 以及導致熒光蛋白淬滅, 限制了有機溶劑透明方法的使用, 降低了其利用率。

Visikol® for Plant Biology™（锘海代理）是2013年Villani等人發(fā)明的專為植物樣本設(shè)計，可替代水合氯醛，快速、易用，樣本無需固定前處理，與免疫組化兼容的透明劑。他們將生姜、冬青、羅勒、牛至及擬南芥組織樣本分別使用Visikol試劑（折射率為1.4450）和水合氯醛進行透明化處理及顯微觀察，結(jié)果表明Visikol試劑對所有被測組織樣本完全可以達到與水合氯醛一樣清晰度的成像效果。（圖3）

圖3. Visikol試劑透明化不同植物組織后顯微成像結(jié)果：羅勒葉片上有氣孔和頭狀、盾狀的腺體的表皮(圖1A)和葉肉細胞和葉綠體(圖1B)。牛至葉脈上的表皮毛(圖1C)、頭狀油腺細胞(圖1D)和盾狀油腺細胞(圖1E)和葉肉細胞(圖1F)。擬南芥根尖分生組織細胞(圖1G)和分化木質(zhì)部(圖1H)

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2．水溶劑性的組織透明化方法

基于有機溶劑的透明技術(shù)無法保持熒光蛋白的的熒光以及脫水引起的組織結(jié)構(gòu)的收縮，使基于有機溶劑的透明技術(shù)受到了限制。水溶劑性的組織透明化方法則具有熒光基團保護性好，生物相容性好及操作安全的優(yōu)點。水溶劑性的組織透明化方法包括被動浸泡型、蛋白水化型和水凝膠包埋型三種方法。

硫二甘醇 (TDE) 是一種水溶性低黏度液體, 可以通過水溶液稀釋調(diào)節(jié)折射率的范圍。透明植物器官成像方法TOMEI (transparent plant organ method for imaging)就是TDE作為透明化試劑的。動物組織樣品在97% TDE溶液中浸泡1–2天后體積變得非常小。而在植物組織中, 用97% TDE處理不會導致植物器官的收縮或膨脹, 植物器官可能因細胞壁的剛性而顯示出對高濃度TDE的耐受性。TOMEI法主要包括固定和TDE處理2個步驟。TOMEI-I使用乙酸和乙醇（1：3，1-2h）的混合液固定樣本，TOMEI-II使用4%PFA（1h）固定樣本。TOMEI-II方法對樣品的形態(tài)和熒光信號保存相比TOMEI-I要好。除去固定因素，高濃度的TDE（95以上）也會使內(nèi)源熒光淬滅，而50–70% TDE可以很好的實現(xiàn)植物透明化而且對植物的樣本形態(tài)和信號保存較好。但是TOMEI依然存在無法完全去除樣品色素和熒光信號降低的缺點。2022年發(fā)表的iTOMEI技術(shù)可以克服TOMEI技術(shù)的缺點。iTOMEI技術(shù)使用1%PFA固定樣本，使用磷酸緩沖液（PH8.0）配制20%的硫代甜菜堿去除植物色素，使用70.4%的碘海醇代替TDE用作折射率匹配試劑（圖4）。

(A)

(B)

圖4.不同植物組織透明化方法比較：（A）擬南芥幼苗分別用PBS, TOMEI-II, iTOMEI透明化處理；（B）對用PBS, TOMEI-II, iTOMEI透明化處理后的擬南芥葉片的H2B-GFP表達情況進行成像。

基于對蛋白質(zhì)進行水化的透明化方法包括樣本脫脂和蛋白水化兩個步驟。為了保護樣品的熒光信號，水性透明化方法使用表面活性劑進行脫脂，表面活性劑的脫脂時間比有機溶劑脫脂時間長。Warner團隊使用Triton X、甘油與尿素結(jié)合使實現(xiàn)了玉米、苜蓿、煙草（豆屬，豌豆屬)和豆科植物的根瘤的組織透明化。Kurihara團隊對多元醇、表面活性劑和尿素組合的化學試劑篩選后建立起木糖醇、脫氧膽酸鈉和尿素相組合的具有高透明效率、多種熒光蛋白信號保護能力并適用多物種多種組織的ClearSee透明化方法。ClearSee在保持熒光蛋白活性的同時, 也降低了葉綠素自發(fā)熒光, 打破了植物組織由于葉綠素存在而造成的成像障礙。因此, 研究人員可使用ClearSee進行多色成像, 并獲得植物樣本中精確的三維結(jié)構(gòu)和特定的基因表達模式。

但是在用ClearSee透明植物樣品的時候，會出現(xiàn)部分樣品褐化的現(xiàn)象，這是由于ClearSee處理會導致一些富含原花青素衍生物的組織被氧化從而使樣品褐化。Daisuke團隊通過在ClearSee中添加還原劑亞硫酸鈉或者半胱胺鹽酸鹽可以有效的防止樣品褐化，從而建立了ClearSeeAlpha透明化方法，鑒于半胱胺鹽酸鹽的價格是亞硫酸鈉的100倍，故在ClearSeeAlpha中使用亞硫酸鈉（圖5）。Nagaki團隊在ClearSee基礎(chǔ)上建立了ePro-ClearSee透明化方法，該法在進行ClearSee透明化以前樣品先進行纖維素酶對細胞壁進行酶解，然后再用異丙醇處理增加樣品的通透性，從而使樣品更加適合進行免疫組化反應(yīng)。

圖5.ClearSeeAlpha可以防止在組織透明化過程中褐色色素的形成：CS: ClearSee;CS4: ClearSee+ 2-aminoethanethiol hydrochloride(半胱胺鹽酸鹽); CS5: ClearSee+ 2- Sodium sulfite (亞硫酸鈉)

PEA-CLARITY是在CLARITY技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種水凝膠包埋型植物透明化方法，該方法通過使用細胞壁降解酶增加細胞壁的通透性, 以及用淀粉水解酶減少淀粉顆粒的光學干擾, 克服了植物因存在細胞壁和淀粉粒而造成的滲透和成像限制，可顯著提高葉片組織的透明度。酶處理在不需要對材料進行任何切片的情況下可使抗體能夠滲透到整個組織中，在保留細胞結(jié)構(gòu)的同時使蛋白質(zhì)在完整組織中進行3D定位。通過對熒光蛋白和抗體標記進行光學成像后, 無需對材料進行任何切片即可獲取蛋白質(zhì)或基因在完整組織中的三維定位。但是PEA-CLARITY透明技術(shù)也存在局限性, 如糖含量較高的組織在長時間透明過程中可能出現(xiàn)褐變現(xiàn)象, 酶處理后的組織更加脆弱, GFP等熒光蛋白的信號會減弱等。此外, 該方法處理周期較長, 通常需要4–6周才能完成樣本透明。

3．其它組織透明化方法

乳酸和水合氯醛是常被用于植物透明化的兩種試劑。它們能被用作植物的透明化試劑，主要是因為它們的折射率在1.43左右，折射率是和植物細胞壁的折射率比較接近的。水合氯醛被廣泛的應(yīng)用于植物的組織透明化，它可以對擬南芥的葉片，花朵，角果等各種組織進行透明化，而且還可以與品紅，苯胺藍，GUS等染色試劑聯(lián)合使用。水合氯醛還可以與希夫試劑聯(lián)合使用對細胞PI染色（mPS-PI）觀察植物的細胞壁。然而水合氯醛具有麻醉性，且會淬滅植物的內(nèi)源熒光，從而使該試劑在植物透明化上受到了一定的限制。

Shih等人使用不同濃度的氫氧化鈉、乳酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)水解酶、水合氯醛、甲苯及各種脂質(zhì)溶劑對種子進行處理, 研發(fā)出一種改進的氫氧化鈉-水合氯醛法, 可用于富含脂肪的種胚進行透明化, 該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于楓樹、油菜、西瓜及向日葵等油脂貯藏量高的種胚透明。

盡管已有多種透明方法成功應(yīng)用于植物組織和器官的成像及其功能研究, 但現(xiàn)有透明方法應(yīng)用于大體積樣品的整體透明、標記與三維成像等方面仍存在巨大挑戰(zhàn)。(1) 較為劇烈的透明化方法可去除細胞內(nèi)大部分光不透明成分, 獲得高度透明樣本, 后期結(jié)合細胞壁特異性染料或抗體進行熒光標記或免疫標記, 可實現(xiàn)大體積樣本內(nèi)細胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)分布的熒光示蹤。但劇烈的透明化處理可能造成細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和成分被嚴重破壞, 難以對亞細胞組分和結(jié)構(gòu)進行標記和后續(xù)分析。 (2) 對于已有遺傳轉(zhuǎn)化體系且含有熒光標記的植物樣本, 可以采用溫和透明方法進行透明化處理后進行三維可視化成像, 但樣本體積過大所需透明時間較長且會降低組織內(nèi)部深處熒光信號的強度和對比度。(3) 對于尚未建立遺傳轉(zhuǎn)化體系的植物樣本, 可以利用抗體免疫標記的方法進行標記與成像, 但仍需根據(jù)成像內(nèi)容和目的選擇合適的透明方法,防止透明化造成目標物丟失。(4) 植物的果實和種子等致密大組織材料內(nèi)糖類、淀粉和脂質(zhì)等含量較多, 透明方法仍需要進一步優(yōu)化�？傊�與動物組織研究相比，植物組織透明化方法的研究仍處于早期階段。鑒于不同植物器官的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和糖成分各不相同，所以植物組織透明化試劑還需要進行進一步系統(tǒng)的篩選。

透明化方法可以使組織透明，但要實現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)的可視化，還需要合適的成像工具。近年發(fā)展起來的光片顯微鏡就是適合組織透明化成像的工具。光片顯微鏡技術(shù)改變了傳統(tǒng)顯微鏡光源照射方式，在同樣信噪比的情況下光片顯微鏡可以將3D成像速度提高到共聚焦顯微鏡或雙光子顯微鏡的數(shù)十到數(shù)百倍，而光毒性減少數(shù)十至數(shù)百倍。因此光片顯微鏡技術(shù)以低光毒性、高速的三維成像優(yōu)勢而被Nature Methods評選為2014年的年度方法學。但是傳統(tǒng)光片顯微鏡存在對厘米級樣本進行微米級或更高分辨率成像時成像效率不高的問題。而平鋪光片技術(shù)作為一種新型的平面光片照明顯微技術(shù)，通過對空間光調(diào)制器加載不同的相位圖實現(xiàn)快速平鋪短而薄的光片，從而達到擴大視場且不影響空間分辨率和光學層析能力，可以獲取在視野范圍內(nèi)各處成像分辨率均一的高分辨率圖像。锘海LS18光片顯微鏡采用了這種平鋪光片技術(shù)，克服了傳統(tǒng)光片顯微鏡中空間分辨率、光學層析能力和成像視野大小之間的矛盾，從而獲得均勻高分辨率的3D熒光圖像，使得3D透明化組織成像在生物醫(yī)學研究中更加可靠及可行。LS18已經(jīng)在腦科學、腫瘤學、藥物研發(fā)、干細胞研究、組織胚胎學、組織病理診斷等各個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

自主研發(fā)新型平鋪光片顯微鏡

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參考文獻：

1. Hériché M, Arnould C, Wipf D, Courty PE. Imaging plant tissues: advances and promising clearing practices. Trends Plant Sci. 2022 Mar 23:S1360-1385(21)00349-6.

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4. Villani TS, Koroch AR, Simon JE. An improved clearing and mounting solution to replace chloral hydrate in microscopic applications. Appl Plant Sci. 2013 May 7;1(5): 1300016.

5. 馬靈玉,祁曉紅, 胡子建, 沈微微, 王廣超, 張柏林, 張曦, 林金星. 光學透明技術(shù)在植物多尺度成像中的應(yīng)用[J]. 植物學報, 2022, 57(1):98-110.

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