NATURE:Inscopix成像下丘腦不同亞群揭示小鼠對同性或異性的攀爬行為

加州理工大學(xué)、HHMI研究院神經(jīng)科學(xué)家David J. Anderson研究團隊于2020年12月2日在NATURE上發(fā)表論文“Distinct hypothalamic control of same- and opposite-sex mounting behaviour in mice”，通過使用滔博生物-Inscopix自由活動鈣成像顯微鏡發(fā)現(xiàn)下丘腦的不同區(qū)域調(diào)控同性和異性小鼠的攀爬行為。
摘要

看上去相似的動物行為卻可以在不同的背景下表達(dá)不同的意圖，但這種靈活性是如何在神經(jīng)環(huán)路水平上實現(xiàn)的目前還不清楚。例如，許多物種的雄性可以表現(xiàn)出對同性或異性的相同行為，但目前還不清楚這些行為的意圖和神經(jīng)編碼是相似的還是不同的。

Anderson研究團隊發(fā)現(xiàn)實驗室雄性小鼠對雌性和雄性的攀爬行為可以通過是否存在超聲發(fā)聲（USV）來區(qū)分。這些和更多的行為數(shù)據(jù)表明，大多數(shù)雄性主導(dǎo)的攀爬是攻擊性的，盡管在極少數(shù)情況下可能是性行為。研究人員調(diào)查了USV+和USV-攀爬是否使用相同或不同的下丘腦神經(jīng)基質(zhì)。通過使用Inscopix自由行為顯微鈣成像方法觀察內(nèi)側(cè)視前區(qū)（MPOA）或腹內(nèi)側(cè)下丘腦腹側(cè)細(xì)分（VMHvl）中ESR1陽性神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)在小鼠活動中可以解碼出在USV+和USV-攀爬過程中神經(jīng)元活動的獨特模式。交叉光遺傳刺激表達(dá)ESR1和囊狀GABA轉(zhuǎn)運蛋白（VGAT）的MPOA神經(jīng)元，可促進USV+攀爬，并將雄性的定向攻擊轉(zhuǎn)換為USV攀爬。

相比之下，刺激表達(dá)ESR1的VMHv1神經(jīng)元會促進USV-攀爬行為，并抑制由雌性誘發(fā)的USV攀爬。

末端刺激實驗表明，這種互補的抑制效應(yīng)是由MPOA和VMHvl之間的相互投射介導(dǎo)的。綜上所述，這些數(shù)據(jù)確定了一個下丘腦亞群，該亞群在遺傳上富含誘導(dǎo)雄性生殖行為狀態(tài)的神經(jīng)元，其可分為由MPOAESR1調(diào)控的生殖神經(jīng)元亞群和由VMHvlESR1調(diào)控的侵襲神經(jīng)元亞群。因此，不同的下丘腦神經(jīng)元群體編碼了表達(dá)不同內(nèi)部狀態(tài)的相似行為。

正文

為了研究小鼠的雌性和雄性導(dǎo)向的攀爬是否可以在行為上被區(qū)分，研究人員首先嘗試訓(xùn)練一個基于機器學(xué)習(xí)的分類器來區(qū)分這兩種情況下的攀爬(圖1a)。使用攀爬次數(shù)的姿勢特征訓(xùn)練的分類器的性能略好于機會(63%)(圖1b，c)。然而，當(dāng)使用在-3s和1s之間提取的相對于攀爬初始時(t=0)的特征進行訓(xùn)練時，分類器性能提高到78%。這表明，相關(guān)行為的特征--而不是攀爬本身--區(qū)分了同性和異性導(dǎo)向的攀爬。

因此，研究人員需要進一步了解哪些相關(guān)行為能區(qū)分雄性小鼠與雌性小鼠之間的攀爬。錄音顯示，雌性導(dǎo)向的攀爬總是伴隨著USVs(圖1e，f，h，k)，而大多數(shù)雄性導(dǎo)向的攀爬則沒有(圖1e-g，k)。此外，雌性導(dǎo)向的攀爬通常之后是骨盆運動和干涉(圖1h，l)，而雄性導(dǎo)向的攀爬之后通常是攻擊(圖1g，m)。在開始的社交接觸中，當(dāng)小鼠缺乏社交經(jīng)驗時(圖1g，i，j)，雄性導(dǎo)向的USV−攀爬更頻繁，隨著小鼠獲得攻擊性經(jīng)驗(圖1n，o中的第2天和第3天)是，USV-攀爬減少。這些數(shù)據(jù)表明，在這種小鼠品系中，大多數(shù)自然發(fā)生的雌性和雄性導(dǎo)向攀爬的案例分別反映了潛在的性動機狀態(tài)和攻擊動機狀態(tài)。
下丘腦是如何對這兩種形式的攀爬進行編碼的呢？

原則上，雌性和雄性導(dǎo)向攀爬可以反映行為特異性神經(jīng)元的存在；這些神經(jīng)元要么是常見的，要么是不同的；另一種情況是，這兩種攀爬行為反映了一種更普遍的內(nèi)在攻擊和性狀態(tài)的編碼。在MPOA和VMHvl中的ESR1+神經(jīng)元之前被認(rèn)為與雄性攀爬有關(guān)。為了直接比較同一小鼠在雌性和雄性導(dǎo)向攀爬期間這兩個群體的活動，研究人員使用光纖記錄同時對MPOAESR1和VMHvlESR1神經(jīng)元進行了鈣信號測量(圖2a，b)。在USV+攀爬期間，前一個區(qū)域的活動相對較高，而在USV−攀爬期間，后一個區(qū)域的活動呈上升趨勢(圖2c，d)。研究人員在雌性和雄性導(dǎo)向的社會行為的其他階段也觀察到了類似的關(guān)系。

值得注意的是，在10只雄性小鼠中，有2只(629號和634號)在雄性導(dǎo)向攀爬期間的活動類似于通常在雌性導(dǎo)向攀爬期間觀察到的活動——即MPOAESR1中的活動相對高于VMHvlESR1神經(jīng)元中的活動。此外，在這兩種情況下，雄性導(dǎo)向攀爬都伴隨著USV。這些罕見的例子可能反映了錯誤的性別識別和/或男性導(dǎo)向的從屬(即雙性)行為，并表明這些核團的神經(jīng)反應(yīng)不單單是入侵者性別的感官表征。

在性(USV+)和攻擊(USV−)攀爬過程中，每個核團中大量ESR1+神經(jīng)元活動的數(shù)量差異(圖2d)可能反映了相同神經(jīng)元活性或ESR1+神經(jīng)元不同亞群的激活的差異。
為了區(qū)分這些替代方案，研究人員使用Inscopix頭戴式自由活動顯微鈣成像系統(tǒng)，在行為自由的小鼠的MPOA或VMHvl6中對ESR1+神經(jīng)元進行了單細(xì)胞分辨率鈣成像(圖2e)。這項技術(shù)是應(yīng)用在社會行為過程中MPOA活動的單細(xì)胞分辨率成像。
 
在MPOA中(在VMHvl中也一樣)，研究人員觀察到不同的ESR1+神經(jīng)元群體在雌性和雄性導(dǎo)向的社會互動中做出反應(yīng)(圖2f)。然而，在MPOA中，偏愛雌性的神經(jīng)元數(shù)量是偏愛雄性的神經(jīng)元的兩倍(18%比9%)(圖2g左)，而在VMHvl中的比例相反(12%比29%)(圖2g右)。在這兩種結(jié)構(gòu)中，群體活動的大部分差異是由入侵者的性別(30-52%)(圖2h中的灰色條)詮釋的，盡管在MPOA中，由行為(57%)(圖2h中的粉色和藍(lán)色條)解釋的差異比在VMHv1中(約37%)的情況更高。
為了進一步研究神經(jīng)活動和行為之間的關(guān)系，研究人員對同步采集的視頻記錄中的行為進行了逐幀標(biāo)記。MPOA和VMHv1都包含不同的神經(jīng)元群體，分別在USV+和USV−攀爬開始時激活(圖2i，j)�？傮w而言，在MPOA(R2=0.61-0.71)和VMHv1(R2=0.77-0.88)中，對于給定性別的入侵者，每個細(xì)胞在攀爬和嗅探期間的相對活動都高度相關(guān)，但在不同性別之間相關(guān)性較差。一小部分神經(jīng)元在攀爬過程中優(yōu)先激活(超過2σ)，但不進行嗅探。這表明，在USV−攀爬過程中觀察到的活動不僅反映了入侵者的性別(這也有助于嗅探過程中神經(jīng)元的激活)，而且至少有一些神經(jīng)元在USV−攀爬行為中被選擇性地激活。然而，在兩種行為中做出反應(yīng)的神經(jīng)元比那些只在一種行為中做出反應(yīng)的數(shù)量更多、激活程度更強。

為了進一步研究行為反應(yīng)的特異性，研究人員計算了每個神經(jīng)元選擇攀爬(USV−或USV+)與探索(嗅探)的概率。神經(jīng)元的選擇概率表明，在神經(jīng)元活動的每個帶標(biāo)記的幀期間，神經(jīng)元的活動能在多大程度上準(zhǔn)確地預(yù)測是在進行攀爬還是探索。在VMHv1和MPOA中，3-11%的ESR1+神經(jīng)元對性（USV+）或攻擊（USV-）攀爬超過了0.7的選擇概率（相對于探索），這高于無序行為標(biāo)記(超過2σ)(圖2k，l)。這證實了這兩個神經(jīng)核團都含有一些神經(jīng)元是與入侵者的性別無關(guān)的細(xì)胞，它們被調(diào)整為可以攀爬的神經(jīng)元。這些神經(jīng)元似乎處于攀爬和探索的相對“調(diào)優(yōu)”的連續(xù)的兩端。然而，在MPOA和VMHv1中，通過選擇概率分析發(fā)現(xiàn)，USV+攀爬神經(jīng)元和USV−攀爬神經(jīng)元之間的重疊很小(圖2m，n)。同樣，在這兩種神經(jīng)核中，對于兩種類型的攀爬過程中優(yōu)先激活的Es1+亞群(超過2σ)在很大程度上是不同的(圖2o，p，s，t中的著色點)。因此，線性解碼器--一種基于支持向量機學(xué)習(xí)算法的二進制分類器--可以被訓(xùn)練成根據(jù)兩個核團中神經(jīng)元活動的模式區(qū)分這兩種類型的攀爬，準(zhǔn)確率為70%-80%(圖2q，r，u，v)。然而，解碼器的性能可能反映了入侵者的性別以及攀爬類型的編碼，因為兩者高度相關(guān)。
接下來，研究人員研究了MPOA和VMHvl在性行為和攻擊行為中各自的因果作用。雖然電刺激MPOA可以促進雄性攀爬，卻可以觀察到激活MPOAESR1神經(jīng)元(圖3c，d中的紫條)對攀爬的促進作用微弱且低效，這證實了之前的一項研究。由于MPOAESR1神經(jīng)元由大約80%的GABA能神經(jīng)元和大約20%的谷氨酸能神經(jīng)元組成，而且由于配對誘導(dǎo)的Fos在視前抑制性神經(jīng)元中的表達(dá)強于興奮性神經(jīng)元，研究人員推測交叉靶向ESR1+GABA能神經(jīng)元可能豐富了促進雄性性行為的MPOA神經(jīng)元。

事實上，使用光遺傳激活Esr1flp Vgatcre(Vgat也被稱為SLC32a1)小鼠(圖3a，b)的MPOAESR1∩VGAT神經(jīng)元，有效地促進了對雄性入侵者的探索和攀爬，相對于使用Esr1cre小鼠(圖3c，d中的藍(lán)色)的刺激強度低一個數(shù)量級(0.5-1.5 mW)。重要的是，刺激MPOAESR1∩VGAT神經(jīng)元會導(dǎo)致USV+同時朝向雄性和雌性入侵者(圖3e-h)，以及一些無生命物體。光遺傳刺激也在孤獨的雄性小鼠中誘導(dǎo)了USV(圖3l)，這證實了發(fā)聲不是伴隨攀爬的，也不是入侵者發(fā)出的。光遺傳誘發(fā)的USV與暴露在雌性小鼠或雌性尿液中的雄性小鼠自然發(fā)出的USV顯示出相似的音節(jié)模式和聲學(xué)特征。值得注意的是，MPOAESR1∩VGAT神經(jīng)元的激活也迅速中斷了正在進行的攻擊，并將其轉(zhuǎn)換為男性導(dǎo)向的USV+攀爬(圖3i-k)。此外，在雌性小鼠中MPOAESR1∩GAT神經(jīng)元的激活，引起了雄性典型的USV+對雄性小鼠和無生命物體的攀爬行為。因此，MPOAESR1∩VGAT神經(jīng)元的激活在雄性和雌性小鼠中都觸發(fā)了一種雄性典型的攀爬行為程序，與目標(biāo)身份無關(guān)。在獨居的雄性小鼠中，MPOAESR1神經(jīng)元的抑制減弱了由雌性尿液誘發(fā)的USVs(圖3m-o)，這表明這些神經(jīng)元對于這種發(fā)聲以及攀爬是必要的，就像之前報道和這里證實的那樣。
弱的光遺傳刺激VMHvlESR1神經(jīng)元可以促進攀爬，而強刺激則促進攻擊。然而，目前還不清楚這種攀爬是有性導(dǎo)向的(USV+)還是攻擊性的(USV-)。錄音表明，弱的VMHvlESR1激活促進了對雌性和被閹割的雄性入侵者的USV−攀爬和攻擊(圖4a-k)。這些結(jié)果表明，由VMHvlESR1神經(jīng)元激活引起的攀爬表現(xiàn)了一種低強度的攻擊行為。然而，VMHvlESR1神經(jīng)元的抑制強烈地抑制了自發(fā)的雌性定向(性)攀爬，證實并擴大了先前關(guān)于弱抑制效應(yīng)的報道。對USV+和USV−攀爬的VMHvlESR1神經(jīng)元增減和功能缺失操縱的差異效應(yīng)可能反映了對不同的雌性和雄性反應(yīng)亞群的影響。

重要的是，VMHvlESR1刺激不僅沒有引起USVs，反而強烈地抑制了雌性入侵者或尿液引起的USVs(圖4l-n)。因此，需要知道這種抑制效應(yīng)是在哪里發(fā)揮的。VMHvlESR1神經(jīng)元強烈投射到MPOA。對MPOA中VMHvlESR1終末的光遺傳刺激強烈地抑制了雌性尿液誘發(fā)的USVs(圖4o-q)，以及雌性導(dǎo)向的攀爬(圖4r)。由于VMHvlESR1神經(jīng)元主要是興奮性的，這種抑制作用可能是通過MPOA中的局部中間神經(jīng)元間接發(fā)生的(圖4u)。然而，并不能排除通過脈沖的反向傳播激活并行目標(biāo)。相反，光遺傳刺激VMHvl中MPOAESR1∩VGAT終末強烈抑制攻擊性(圖4s，t)。因此，MPOA投射的VMHvlESR1(ESR1VMHv1→MPOA)和VMHv1投射的MPOAESR1∩VGAT(ESR1∩VGATMPOA→VMHv1)神經(jīng)元的激活分別抑制了雌性導(dǎo)向的攀爬和雄性的攻擊，這意味著一個先前提出的相互抑制的環(huán)路動機(圖4u)。
研究人員已經(jīng)研究了下丘腦是如何控制雄性對同性和異性導(dǎo)向的攀爬。發(fā)現(xiàn)，這兩種形式的攀爬是不同的行為，由不同的下丘腦細(xì)胞群控制。單個神經(jīng)元的成像實驗顯示了相對罕見的USV+或USV−攀爬選擇性細(xì)胞群；大多數(shù)MPOAESR1和VMHvlESR1神經(jīng)元對特定性別的入侵者表現(xiàn)出多種社會行為的混合選擇性。這些數(shù)據(jù)表明，這兩個主要神經(jīng)元亞群分別主要控制繁殖和攻擊狀態(tài)，這解釋了光遺傳刺激的顯性行為效應(yīng)。然而，與VMHvl一樣，MPOA也包含一小部分神經(jīng)元(約9%)(圖2g)，這些神經(jīng)元在相反的狀態(tài)下被選擇性地激活。在VMHvl的情況下，似乎雌性偏好神經(jīng)元是交配行為所必需的。在MPOA的情況下，雄性偏好的ESR1+亞群可以間接促進攻擊性，也可以在戰(zhàn)斗中抑制不斷增加的攻擊性。研究數(shù)據(jù)表明，攻擊性和生殖(性)狀態(tài)是由分布在下丘腦多個核團中的異質(zhì)細(xì)胞群所影響的。表面上相似的運動動作可以由不同的神經(jīng)亞群控制，這些神經(jīng)亞群在下丘腦水平上編碼相反的動機狀態(tài)。

參考文獻：
Tomomi Karigo, David J. Anderson et al., Distinct hypothalamic control of same- and opposite-sex mounting behaviour in mice, Nature(2020)

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