OCTA | 柔腦膜側(cè)支循環(huán)障礙導(dǎo)致2型糖尿病小鼠卒中預(yù)后不良

側(cè)支狀態(tài)可獨(dú)立預(yù)測卒中結(jié)果，但對于腦缺血期間側(cè)支循環(huán)如何維持腦灌注我們還了解甚少。已知糖尿病會加重缺血性腦損傷，但糖尿病對側(cè)支動態(tài)的影響也還未知。因此，美國和日本研究人員Yosuke Akamatsu等使用Doppler光學(xué)相干斷層掃描（DOCT）對小鼠卒中前后的柔腦膜側(cè)支狀態(tài)進(jìn)行了成像研究，發(fā)現(xiàn)在C57BL/6小鼠大腦中動脈（MCA）阻塞后立即檢測到柔腦膜側(cè)支循環(huán)募集，并持續(xù)生長。相反在2型糖尿病db/db小鼠模型中觀察到側(cè)支募集障礙，伴隨卒中預(yù)后結(jié)果很差。MCA卒中后7天，db/db小鼠仍表現(xiàn)出長期性的逆向MCA回流顯著減少。通過靜脈注射葡萄糖對比研究發(fā)現(xiàn)，db/+小鼠急性誘導(dǎo)高血糖并不會導(dǎo)致卒中后側(cè)支循環(huán)障礙，表明僅高血糖狀態(tài)并不足以影響側(cè)支循環(huán)。此外人白蛋白能顯著改善db/db小鼠卒中后的側(cè)支循環(huán)和卒中結(jié)果。研究成果以“Impaired Leptomeningeal Collateral Flow Contributes to the Poor Outcomefollowing Experimental Stroke in the Type 2 Diabetic Mice”發(fā)表于Neurobiology of Disease。

  背景

 2型糖尿�。═2DM）是誘發(fā)缺血性卒中的主要危險(xiǎn)因素，并且與卒中后長期功能缺陷的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，但尚不完全清楚是什么機(jī)制導(dǎo)致這一人群卒中結(jié)果更差。30%-40%的急性缺血性卒中患者存在高血糖，且高血糖與不良預(yù)后獨(dú)立相關(guān)，即使在那些沒有被診斷患有糖尿病的人中也是如此。已知高血糖會增加腦缺血期間的氧化應(yīng)激，但尚不清楚急性高血糖本身或其他潛在的血管病理是否會導(dǎo)致發(fā)病率增加。

 臨床證據(jù)表明，側(cè)支狀態(tài)可預(yù)測缺血性卒中患者溶栓治療結(jié)果和反應(yīng)，良好的側(cè)支狀態(tài)可以降低溶栓和血管內(nèi)治療后出血轉(zhuǎn)化的比例。此外代謝綜合征患者在急性缺血性卒中期間側(cè)支狀態(tài)也較差。因此亟需明確T2DM病患者卒中期間是否出現(xiàn)腦側(cè)支循環(huán)調(diào)節(jié)受損，以及該受損是否與高血糖癥有關(guān)。

 在臨床前和臨床卒中研究中發(fā)現(xiàn)，人白蛋白是一種有效的神經(jīng)保護(hù)劑，可以改善血液循環(huán)。然而，尚不清楚白蛋白是否能增強(qiáng)大腦中動脈（MCA）卒中中柔腦膜側(cè)支的流動，以及對血管介入無反應(yīng)的糖尿病受試者來說，白蛋白是否有效。

 多普勒光學(xué)相干斷層成像技術(shù)（DOCT）是一種評估動態(tài)腦血流的新技術(shù)，具有良好的空間分辨率和速度定量靈敏度。能夠在完整顱骨情況下，以相對較高的速度同時(shí)對多個(gè)單獨(dú)血管中通過的血流進(jìn)行量化，還能通過重復(fù)測量提供絕對血液灌注值。本研究首次使用DOCT檢測了正常和T2DM糖尿病小鼠MCA卒中后柔腦膜側(cè)支血循環(huán)的空間和時(shí)間變化。結(jié)果表明，T2DM小鼠MCA卒中后側(cè)支血流動力學(xué)受損并不歸因于急性高血糖癥，并且人白蛋白改善卒中后側(cè)支循環(huán)狀態(tài)，增強(qiáng)回流側(cè)支血流深入到近端MCA區(qū)域。
   

 

圖1 DOCT系統(tǒng)定量微血管成像的示意圖。

 結(jié)果
 01-缺血性卒中后柔腦膜側(cè)支循環(huán)隨時(shí)間的進(jìn)展和生長情況
 使用DOCT觀察到大腦中動脈阻塞（MCAO）后，MCA血液流動方向逆轉(zhuǎn)，被稱為逆向血流，與基線狀態(tài)時(shí)的順行流動方向相反（圖2A，B）。MCAO手術(shù)后，連接遠(yuǎn)端MCA和ACA的彎曲側(cè)支吻合變得明顯（圖2B）。基線時(shí)，檢測到流速和流量從近端到遠(yuǎn)端MCA逐漸減�。▓D2A，E，H，J），而血管直徑保持不變（圖2I）。MCAO后，流速和流量普遍降低（圖2B，F(xiàn)，H，J）。
 為提高比較準(zhǔn)確性，根據(jù)分支順序?qū)﹂]塞點(diǎn)下游的MCA分支進(jìn)行分類，其中Seg 1最靠近ACA，距MCA最遠(yuǎn)；Seg 3相對于Seg 2距MCA較近，距ACA最遠(yuǎn)（圖2G）。在MCAO期間，Seg 1-3流速分別較基線下降56%、31%和13%。此后，Seg 3的流速在MCAO后24 h和7天顯著增加（p＜0.05，p＜0.005）（圖2C，D，H）。與基線相比，Seg 1的MCA直徑在MCAO后7天或MCAO期間也同時(shí)增加（p＜0.05，p＜0.01），在其它時(shí)間點(diǎn)沒有顯著變化（圖2I）。與流速相似，流量在MCAO期間也減小，但Seg 3流量在MCAO后7天增加（p＜0.001）（圖2J）。
 

 

圖2 MCAO后血液流速、流量和動脈直徑的時(shí)空流動動力學(xué)。（A-D）同一只小鼠MCAO前、中、后的DOCT圖像。白色和黑色實(shí)心箭頭分別表示MCA和ACA分支。血液流動的方向是彩色編碼的，流向掃描探針光束的血液被標(biāo)記為紅色，相反方向的標(biāo)記為綠色。（E，F）基線和MCAO期間的動脈樹，展示了不同點(diǎn)的流向和流速。（G）MCA分支的分類示意，最遠(yuǎn)端的為Seg1，最近端的為Seg 3。（H）MCAO前后流速變化情況，Seg 3中流速隨時(shí)間逐漸增加。（I）血管直徑變化情況，Seg 1直徑在MCAO后第7天相對于基線和MCAO期間有所擴(kuò)大，表明卒中后側(cè)支血管的生長。（J）流量變化情況。

 02-db/db小鼠表現(xiàn)出柔腦膜側(cè)支循環(huán)募集障礙，且卒中結(jié)果更差

 基線狀態(tài)下的生理評估顯示，db/db小鼠的血糖濃度和體重顯著高于正常血糖、年齡一致的db/+小鼠（表1），這與胰島素耐受性的效果一致，也與之前的發(fā)現(xiàn)一致，即db/db小鼠在MCAO期間血壓略高（db/db：92.5±6.5 mmHg；db/+：81.8 ±3.4 mmHg；p＜0.05）。
 
兩基因型在基線狀態(tài)下的血液流速、流量和血管直徑都沒有差異（圖3A-D）。然而MCA阻塞期間，db/db小鼠從ACA逆行填充MCA的血流較db/+組減少很多，在所有節(jié)段中的流速都顯著降低（圖3A-D）。但MCAO后短時(shí)間內(nèi)各組間各節(jié)段的血管直徑無顯著差異。流量情況與流速相似，db/db小鼠Seg 3的流量在MCAO期間及MCAO后顯著降低（p＜0.05），表明側(cè)支循環(huán)募集受損，尤其是在近端MCA分支中。長期研究發(fā)現(xiàn)，慢性卒中期間，db/db小鼠中觀察到的側(cè)支循環(huán)損傷似乎長期存在（圖3E-H）。盡管在MCAO后第7天，兩組的側(cè)支血流和血管均有增長，但db/db小鼠所有節(jié)段中的流速都顯著小于db/+組（圖3E-H）。

 

 

圖3 db/db小鼠MCAO后側(cè)支循環(huán)募集障礙。（A）db/db和db/+小鼠在基線、MCAO期間、重新灌注期間、灌注24h后的DOCT圖像。（B-D）兩組小鼠每節(jié)段血管中流速、血管直徑和流量與時(shí)間的線性圖。（E）兩組小鼠在基線、重新灌注期間、卒中后7天的DOCT圖像。箭頭表明兩種小鼠品系都有明顯的側(cè)支重塑。（F-H）重新灌注與MCAO后7天間，各節(jié)段流速、血管直徑和流量的變化。

 

與異常的側(cè)支狀態(tài)相關(guān)的顯著惡化卒中結(jié)果體現(xiàn)在MCAO后7天，對梗死面積（p＜0.01；圖4A），以及運(yùn)動功能（云梯測試：p＜0.01；圖4B；轉(zhuǎn)角測試：p＜0.05;圖4C）的評估方面。在糖尿病小鼠中，更差的卒中結(jié)果對應(yīng)更大的病變尺寸，而在高血糖患者卒情況中，也對應(yīng)著更差的NIHSS和改良Rankin量表評估結(jié)果。
   

 

圖4 MCAO對db/+和db/db小鼠的影響。（A）梗塞體積；（B）云梯測試；（C）轉(zhuǎn)角測試。

 

為排除遺傳變異對腦血管系統(tǒng)的潛在影響，對db/+和db/db小鼠進(jìn)行了DiI動脈標(biāo)記。在連接ACA和MCA的側(cè)支數(shù)目（圖5A，B）、ACA和MCA吻合與中線的距離（圖5C）或PcomA的開放性（圖5D）方面，都沒有觀察到顯著差異。表明是側(cè)支募集功能發(fā)生了障礙，而側(cè)支循環(huán)結(jié)構(gòu)沒有缺陷。此外，為確定卒中后續(xù)對側(cè)支間連接的效應(yīng)，在MCAO后7 天定量了同側(cè)腦半球中通過ACA逆向灌注的MCA的數(shù)量。發(fā)現(xiàn)與db/db組相比，db/+側(cè)支血管直徑增加以容納更多血流，同側(cè)腦半球的ACA和MCA之間的邊界區(qū)域周圍彎曲側(cè)支吻合出現(xiàn)顯著擴(kuò)張（圖5A，箭頭）。而db/db小鼠的情況相反， MCAO后1周MAC和ACA間灌注的柔腦膜側(cè)支較少（p＜0.05；圖5A，B）。

 

 

圖5 db/db小鼠與db/+小鼠在MCA和ACA之間的柔腦膜吻合程度、MCA區(qū)域的尺寸、Pcom開放性方面相似。（A）兩品系的DiI標(biāo)記動脈造影圖。黃色插圖放大顯示了MCA和ACA血管網(wǎng)之間的連接點(diǎn)。（B）DiI灌注測量基線和MCAO后7天MCA和ACA間的連接側(cè)支數(shù)量。（C）根據(jù)DiI動脈標(biāo)記法測定，兩組小鼠在基線時(shí)ACA與MCA間吻合線與中線間的距離無顯著差異。（D）PcomA開放性各組間無顯著差異，表明兩種小鼠具有相似的初級側(cè)支循環(huán)程度。

 

03-僅急性高血糖不足以導(dǎo)致側(cè)支循環(huán)募集障礙

 為確定在T2DM卒中小鼠中觀察到的側(cè)支募集障礙是否歸因于高血糖本身，在誘發(fā)卒中前對db/+小鼠進(jìn)行了60 min葡萄糖溶液輸注。通過劑量滴定研究確定葡萄糖的最佳量為1.25 g/kg，以匹配db/db小鼠約380 mg/dl的血糖水平（圖6A）。腹腔注射葡萄糖溶液后，葡萄糖代謝與野生型小鼠間無顯著差異（RANOVA:F_（132）=0.17，p＞0.68）（圖6B）。時(shí)間進(jìn)程研究表明誘導(dǎo)組的血糖在卒中和成像期間維持在與db/db小鼠相當(dāng)?shù)乃�平（圖6C）。在MCAO后，所有組血糖都有升高的趨勢，但與MCAO前血糖水平相比無顯著差異（圖6C）。誘導(dǎo)高血糖的db/+小鼠MCAO后24h血糖水平恢復(fù)至正常范圍。db/db小鼠在MCAO后24 h雖然血糖水平也出現(xiàn)了暫時(shí)降低，但在2天后逐漸恢復(fù)到高血糖狀態(tài)（圖6C）。
   

 

圖6 在db/+小鼠中通過葡萄糖誘導(dǎo)高血糖。（A）腹腔內(nèi)注射不同劑量的25%葡萄糖溶液后，血糖呈劑量依賴性升高。（B）以1.25 g/kg葡萄糖給藥后的90 min內(nèi)，比較db/+和野生型同窩小鼠的血糖代謝。（C）MCAO前、中、后，db/db小鼠、誘導(dǎo)高血糖小鼠、db/+小鼠（對照）的血糖水平。與C57BL/6小鼠類似，正常血糖和高血糖db/+小鼠中，MCA血流方向在所有節(jié)段中都是反向的（圖7A）。在基線或MCAO期間，各組之間的流速、血管直徑和流量無顯著差異（圖7A-D），表明暫時(shí)誘導(dǎo)的高血糖不足以影響側(cè)支血流動力學(xué)。

 

圖7 db/+小鼠中急性誘發(fā)的高血糖不會損害卒中期間柔腦膜側(cè)支循環(huán)。（A）在基線和MCAO期間，高血糖和正常血糖對照小鼠的DOCT圖像。箭頭表示在MCAO期間，兩組中都有強(qiáng)勁逆向血流（綠色）到達(dá)近端MCA分支。（B）流速；（C）直徑；（D）流量的定量數(shù)據(jù)。表明高血糖和對照之間的血流動力學(xué)和功能動脈直徑?jīng)]有顯著差異，基線和MCAO期間都是如此。

  04-人白蛋白能夠增加db/db小鼠的側(cè)支灌注并減小梗塞面積

 為確定白蛋白對缺血性卒中后側(cè)支循環(huán)的影響，在MCAO后150 min或CCA再灌注后60 min，靜脈輸注白蛋白或鹽水。處理前后分別對應(yīng)缺血再灌注后30 min和90 min，對側(cè)支血流進(jìn)行成像（圖8A）。白蛋白處理前，db/db組各節(jié)段的流速和流量都明顯低于db/+組，流速Seg 1/Seg 2/Seg 3：p＜0.05/p＜0.01/p＜0.01；流量Seg 1/Seg 2/Seg 3：p＜0.05/p＜0.05/p＜0.05（圖8B，C，E），血管直徑無顯著差異（圖8D）。
 研究發(fā)現(xiàn)，白蛋白顯著改善了糖尿病小鼠的側(cè)支循環(huán)募集情況（Seg 1、3：p＜0.05；Seg 2：p＜0.01），尤其是在近端MCA（圖8F）。雖然db/db小鼠鹽水或白蛋白處理后30 min，所有節(jié)段的MCA直徑都有略微減小的趨勢，但兩種處理方法間相對直徑變化沒有顯著差異（圖8G）。在Seg 2和Seg 3中，與鹽水處理相比，白蛋白處理后相對血流量有顯著提高（Seg 2：p＜0.005；Seg 3：p＜0.05）（圖8H）。白蛋白對近端MCA分支流速和流量情況的改善相對較明顯，表明白蛋白處理后，來自ACA的逆向血流能到達(dá)更遠(yuǎn)的距離。而db/+小鼠白蛋白處理后，流速的相對增加并不太明顯，與鹽水處理組間也無顯著差異，ACA遠(yuǎn)端節(jié)段中的相對流速也沒有優(yōu)先增加，這是由于db/+小鼠中已存在良好的側(cè)支募集，此外db/+小鼠的相對直徑變化也不顯著。同時(shí)db/+小鼠中，兩種方法處理后血液通量都略有改善間，因此相對流量變化并沒有顯著差異（圖8H）。這些結(jié)果表明，白蛋白能有效改善db/db小鼠MCA卒中后柔腦膜側(cè)支循環(huán)，使其逆行血流到達(dá)MCA區(qū)域的閉塞點(diǎn)附近。

 在卒中后第7天，白蛋白處理的db/db小鼠與鹽水處理小鼠相比，表現(xiàn)出明顯較小的梗塞體積（白蛋白vs鹽水：3.4±0.4% vs 5.0±0.4%，p＜0.05）。盡管白蛋白對神經(jīng)保護(hù)方面有顯著效果（two-way ANOVA，F(xiàn)_（1,18） = 9.2，p＜0.01），但并沒有有效減少db/+小鼠的卒中尺寸（1.9±0.4% vs 3.0±0.5%，不顯著），表明白蛋白的作用有限（圖8I）。

 

 

 

圖8 人白蛋白能顯著增加db/db小鼠缺血性再灌注后近段MCA分支方向的逆向血流。（A）卒中、成像、處理的時(shí)間線。（B）再灌注后30 min和90 min的DOCT圖像。（C-E）處理前db/db小鼠與db/+小鼠血液流速、流量和血管直徑的對比。（F-H）白蛋白和鹽水處理后，db/db和db/+小鼠血液流速、流量和血管直徑的對比。（I）卒中后7天各組的梗塞尺寸對比。

  結(jié)論
 本研究使用DOCT首次證明了側(cè)支募集是通過MCA及其之間的吻合連接直接進(jìn)行的，對以前的研究結(jié)果進(jìn)行了補(bǔ)充，證明了柔腦膜側(cè)支吻合為MCAO后的缺血區(qū)提供了快速和持續(xù)的灌注。此外，MCAO后7天，側(cè)支血流會繼續(xù)增加，且血管重構(gòu)程度相當(dāng)大。通過對比db/db和db/+小鼠，證明糖尿病小鼠側(cè)支循環(huán)障礙是大腦血管的慢性病理改變引起的，而不是由急性高血糖單獨(dú)導(dǎo)致的。此外，白蛋白能夠顯著改善逆向血液灌注，減少db/db小鼠的梗死體積，但在側(cè)支狀態(tài)良好的db/+小鼠中白蛋白并無顯著的改善效果。因此，T2DM小鼠在慢性灌注不足期間，側(cè)支化的失敗可能會導(dǎo)致血液動力學(xué)損傷，從而增加缺血性卒中的風(fēng)險(xiǎn)。

 參考文獻(xiàn)Akamatsu, Y. , et al. "Impaired Leptomeningeal Collateral Flow Contributes to the Poor Outcome following Experimental Stroke in the Type 2 Diabetic Mice." Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience 35.9(2015):3851-64.