使用多參數(shù)OCT研究局灶缺血小鼠模型

腦缺血性卒中涉及復(fù)雜的神經(jīng)元和血管事件級聯(lián)，會造成腦組織損傷。在卒中發(fā)展早期階段進(jìn)行成像可以預(yù)測組織梗死和半暗帶，從而能夠確定最佳干預(yù)措施，以補救腦功能損傷。因此，開發(fā)相應(yīng)的能在缺血性卒中早期表征腦損傷的成像技術(shù)是當(dāng)務(wù)之急。美國華盛頓大學(xué)和韓國中央大學(xué)研究人員Woo June Choi等基于OCT成像提供的內(nèi)源性光散射信號，開發(fā)了多參數(shù)OCT成像系統(tǒng)，在小鼠局灶腦缺血模型中，能夠在急性階段（血液閉塞后5分鐘到最初幾小時），成像顯示體內(nèi)的多種血液動力學(xué)和組織散射反應(yīng)，包括腦血流量不足、毛細(xì)血管不灌注、穿透血管移位和皮質(zhì)組織中與梗死核心空間相關(guān)的光衰減增加（TTC染色確定）。證明多參數(shù)OCT成像有助于卒中早期缺血性病變的綜合評估，為指導(dǎo)治療決策提供必要信息。文章以“Monitoring acute stroke progression: multi-parametric OCT imaging ofcortical perfusion, flow, and tissue scattering in a mouse model of permanentfocal ischemia”為題發(fā)表于IEEE Trans Med Imaging。
 
 背景

 缺血性卒中時，閉塞后的腦損傷隨時間演變，從超急性期（幾分鐘）到急性期（幾小時），最終到慢性期（幾天）。閉塞后幾分鐘內(nèi)，缺血損傷中心的腦組織經(jīng)歷了最劇烈的血量減少，達(dá)10ml/100g/min（正常的20 %）及以下，產(chǎn)生的嚴(yán)重缺氧環(huán)境會導(dǎo)致神經(jīng)元壞死。包圍這種這種壞死組織（也稱為梗塞核心）的是一個低灌注邊緣組織（10-20ml/100g/min；約正常的30-40%），稱為缺血半暗帶。與梗死核心不同，半暗帶區(qū)在功能上受到抑制，但結(jié)構(gòu)和代謝保持完整。半暗帶的及時再灌注有機(jī)會幫助可挽救組織恢復(fù)功能，以免其在數(shù)小時內(nèi)永久發(fā)展為梗死。因此在設(shè)計卒中急性期靶向治療時，理解和描述可挽救腦組織的血液動力學(xué)事件至關(guān)重要。

 在治療干預(yù)前，對卒中發(fā)作后的腦進(jìn)行成像，可了解腦組織缺血的嚴(yán)重程度和范圍，這對于確定及時的治療方案和評估治療預(yù)后至關(guān)重要。以前對動物和人類卒中研究中，已經(jīng)使用過正電子發(fā)射斷層掃描（PET）、擴(kuò)散/灌注加權(quán)磁共振成像（MRI）和灌注計算機(jī)斷層掃描（PCT）等重要的腦灌注成像技術(shù)。其中PET通過評估局部腦血流（CBF）和腦代謝之間的關(guān)系，被認(rèn)為是當(dāng)前活體檢測梗塞核心和半暗帶的標(biāo)準(zhǔn)。然而其應(yīng)用性受限于其使用的復(fù)雜邏輯，并且由于使用放射性示蹤劑，大腦也不可避免地暴露于輻射。此外示蹤劑注射和成像之間所需的延遲太長（2小時以上），進(jìn)一步限制了PET在急性缺血性卒中治療決策中的廣泛應(yīng)用。擴(kuò)散/灌注加權(quán)MRI也是急性評估卒中的常規(guī)方法，其中擴(kuò)散/灌注不匹配區(qū)域可用作早期卒中患者半暗帶的替代標(biāo)記物。盡管臨床結(jié)果令人滿意，但其方法學(xué)結(jié)論存在爭議。PCT已應(yīng)用于常規(guī)快速CT掃描儀進(jìn)行腦灌注成像，對于早期缺血半暗帶和梗死核心的快速評估非常有幫助。但與PET類似，這種方法需要使用侵入性的放射性造影劑，會給身體帶來輻射影響。

 光學(xué)相干斷層掃描（OCT）是一種無創(chuàng)、無標(biāo)記的光學(xué)成像技術(shù)，能夠在幾毫米的視野范圍內(nèi)以微米級的分辨率分辨活體生物組織的顯微解剖結(jié)構(gòu)。OCT掃描協(xié)議和后處理算法的發(fā)展實現(xiàn)了提取血液灌注和血流速度，以及灌注組織的光學(xué)特性信息，即功能性O(shè)CT。OCT血管造影術(shù)（OCTA）已用于活體探索小鼠缺血性卒中模型的皮質(zhì)脈管系統(tǒng)和血流動力學(xué)。OCTA能夠增強紅細(xì)胞在血管腔中移動的運動對比，可在無需外源造影劑的情況下，實現(xiàn)小鼠大腦皮質(zhì)中精細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)和循環(huán)的可視化。此外使用OCT信號的組織表征技術(shù)可準(zhǔn)確確定缺血性損傷的程度，使用這種方法可創(chuàng)建出小鼠皮質(zhì)組織的光學(xué)衰減系數(shù)圖譜，其中衰減系數(shù)通過分析由于光吸收和散射引起的接收到的OCT信號的衰減來測量。受損皮質(zhì)組織衰減的變化可用于區(qū)分缺血核心和半暗帶。以前所有使用OCT的研究中，通常在小鼠卒中發(fā)作后幾小時才監(jiān)測大腦缺血性損傷。雖然足以評估缺血性損傷導(dǎo)致的血液動力學(xué)和組織特性變化，但血管閉塞后幾分鐘至幾小時內(nèi)發(fā)生的關(guān)鍵病理生理學(xué)事件仍不清楚。

 本研究使用單一OCT成像平臺監(jiān)測了卒中發(fā)作后幾分鐘至前3小時小鼠大腦的血液動力學(xué)和結(jié)構(gòu)變化。采用大腦中動脈遠(yuǎn)端閉塞（dMCAO）模型誘導(dǎo)小鼠大腦局灶性缺血性卒中。OCT成像平臺測量了血液灌注、速度、流量和光衰減多種參數(shù)，由此可以表征卒中急性期皮質(zhì)脈管系統(tǒng)、CBF、毛細(xì)血管灌注和組織散射的演變變化。對血管和組織損傷的綜合評估揭示了發(fā)生在缺血半暗帶和梗死核心的不同事件。

 

 圖1健康小鼠顱窗制備及活體大腦OCT成像。（A）截面（x-z）OCT圖像，描述大腦皮質(zhì)的解剖細(xì)節(jié)，顯示灰質(zhì)（GM）和白質(zhì)（WM）。（B）對應(yīng)的橫截面（x-z）OCTA圖像，表示皮質(zhì)中的血液灌注。（C）深度相關(guān)信號衰減補償前的截面衰減系數(shù)圖像。用（E）中SD-OCT系統(tǒng)歸一化靈敏度滾降信號的峰值幅度的擬合函數(shù)H (z)（虛線）進(jìn)行校正，得到（D）補償圖像。（F）衰減深度剖面圖比較（C和D中白線）顯示了補償后衰減系數(shù)的降低值。灰色陰影區(qū)域表示具有明顯更高的衰減系數(shù)的白質(zhì)（WM）的位置。（G）皮質(zhì)表面下350μm處（A中兩條紅色虛線間）的3D OCT的最大振幅投影（MAPs）展示結(jié)構(gòu)。（H）OCTA展示血管。（I）衰減系數(shù)。

 

  圖2相對腦血流量（rCBF）測量。（A）dMCAO后2.5h的卒中腦照片。箭頭為大腦血液閉塞部位。插圖為該位置dMCAO后1.5h的血管造影照片，其中缺血區(qū)域在空間上以同心模式擴(kuò)大（黃色虛線）。（B）彩色rCBF空間分布，覆蓋了dMCAO后1.5h血管造影照片。（C）rCBF分布圖，帶有與血液阻塞部位的距離。IC，梗死核心；P，半暗帶；BO，良性缺血區(qū)；N，正常。

 結(jié)果
 01-dMCAO后腦血液灌注和流速的急性變化
 每2min對卒中模型小鼠大腦（n=5）進(jìn)行OMAG和DOMAG測量，連續(xù)進(jìn)行3h。圖3為一只動物OMAG和DOMAG圖像的時間進(jìn)程，分別表示灌注圖和血流軸向速度圖。OMAG圖像（圖3A）中，MCA分支中的血流由于遠(yuǎn)端MCA閉塞而顯著減少，導(dǎo)致毛細(xì)血管灌注減少，且低灌注區(qū)域隨時間推移（約130min）稍微擴(kuò)展。與此同時，遠(yuǎn)離缺血腦區(qū)域的ACA區(qū)域存在類似的毛細(xì)血管無灌注，該區(qū)域毛細(xì)血管灌注從近端ACA向大腦側(cè)支開始減少（14、16和40min的OMAG圖像中約8點方向），灌注下降持續(xù)了近20min。然而之后灌注慢慢恢復(fù)到基線水平（64、78、98和114min的OMAG圖像中約8點方向）。

 DOMAG圖像（圖3B）顯示了表層軟腦膜血管和穿透血管中紅細(xì)胞軸向流速的時間進(jìn)程變化，而不是毛細(xì)血管中的。DOMAG信號用梯度顏色編碼表示速度，范圍從-6.1mm/s到6.1mm/s。下潛小動脈和上升小靜脈分別用離散的綠色和紅色表示�？梢娙毖�性腦區(qū)域穿透血管的流速連續(xù)降低，而非缺血性ACA區(qū)域中的穿透血管流速逐漸恢復(fù)到基線，與OMAG圖像中的毛細(xì)血管灌注反應(yīng)類似。由于穿透小動脈在將軟腦膜動脈血流分配到下游毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用，穿透小動脈中的血流中斷對相應(yīng)OMAG圖像中觀察到的毛細(xì)血管密度影響顯著。小ROI圖像（1mm× 1mm）展示了非缺血性和缺血性腦組織中的血流動力學(xué)（圖3C，D）。

 

 圖3時間順序的OMAG和DOMAG圖像，顯示年輕成年小鼠大腦皮質(zhì)中血液灌注和血流速度的同步變化。（A）OMAG圖像顯示腦血流灌注從基線到dMCAO后131min的變化。右邊刻度代表反射率對數(shù)灰度。（B）偽彩色DOMAG圖像顯示腦血管中紅細(xì)胞流速及流向。紅色代表向入射探測光束（負(fù)）移動，綠色代表相反（正）方向；色調(diào)表示速度，從-6.1mm/s到+6.1mm/s。通過分別靠近（C）ACA和（D）MCA的小區(qū)域（1mm× 1mm）視圖可以清楚觀察到灌注和血流速度的動態(tài)變化。 

 02-dMCAO后腦血流的急性變化

 研究了dMCAO后CBF相對于基線值的百分比變化。在相應(yīng)的OMAG圖像上以假彩色顯示dMCAO后rCBF的空間分布（圖4A）。較暖的顏色對應(yīng)較高的基線CBF百分比。可見由于dMCAO，急性缺血后的CBF基于皮質(zhì)位置表現(xiàn)出兩種不同反應(yīng)。在靠近閉塞MCA部位的缺血區(qū)，rCBF水平單調(diào)下降（變得越來越藍(lán)），而靠近ACA的非缺血區(qū)的rCBF水平最初下降（從紅色變?yōu)辄S色），然后逐漸恢復(fù)到基線水平。

 測量每只小鼠（n=5）三個空間位置（P1、P2、P3，分別距閉塞位置2.5、3.5、4.5mm）CBF的相對變化的時間進(jìn)程（圖4B）。P1（最靠近閉塞）處的rCBF曲線表明，動脈閉塞后幾分鐘內(nèi)，CBF值顯著下降至基線值的約60 %（半暗帶），閉塞后3h內(nèi)進(jìn)一步下降至基線值的20 %以下（梗死核心）。同樣，P2（靠近局部灌注不足）處rCBF曲線顯示，3h內(nèi)CBF從基線的70%降至約35%，對應(yīng)良性缺血區(qū)至缺血半暗帶的CBF閾值。然而P3（離局部灌注不足最遠(yuǎn)）的rCBF曲線通常在3h內(nèi)呈現(xiàn)出典型的凹上形狀，CBF在dMCAO后25min內(nèi)下降到基線的約70 %，在20min的平穩(wěn)CBF灌注后，逐漸恢復(fù)到基線的90%，在已知良性缺血區(qū)的CBF閾值范圍內(nèi)（基線的66-92%）。
 

 圖4 CBF對急性腦缺血反應(yīng)的時空變化。（A）與相應(yīng)的OMAG圖像（灰度）重疊的偽彩色CBF時間進(jìn)程。較暖色代表較高的基線CBF水平百分比（%）。（B）三個不同位置rCBF反應(yīng)的平均軌跡，顯示CBF相對于基線的急性卒中相關(guān)的相對變化。

 03-dMCAO后衰減系數(shù)的急性變化

 衰減系數(shù)的時間歷程圖展示了dMCAO后皮質(zhì)組織散射特性的變化（圖5A）。觀察到局灶缺血周圍的皮質(zhì)區(qū)（圖5A右側(cè)）衰減系數(shù)增加（>3mm^-1），并且隨著腦缺血的進(jìn)展該區(qū)域空間上出現(xiàn)擴(kuò)展，這清楚表明外側(cè)的皮質(zhì)散射特性發(fā)生了變化。此外皮質(zhì)區(qū)域的邊緣（圖5A中箭頭）在dMCAO后8min出現(xiàn)，并表現(xiàn)出明顯更高的衰減系數(shù)（> 4.5mm^-1），隨時間推移而擴(kuò)展。這一明顯的邊界區(qū)域劃分出了中等衰減系數(shù)亮度區(qū)域（圖5A右側(cè)）。圖5B為dMCAO后130min的OMAG圖像（紅色）和衰減系數(shù)圖（綠色）的疊加。非灌注區(qū)域的邊界在空間上與衰減系數(shù)的邊界區(qū)域相關(guān)，表明缺血腦的特征是血液灌注以及皮質(zhì)組織光散射的變化。在OCT成像的終點（dMCAO后130min）對成像小鼠的大腦進(jìn)行TTC染色，以檢查腦損傷（圖5C）。染色結(jié)果可見配準(zhǔn)的衰減邊緣區(qū)和白色區(qū)域（梗塞核心）。因此，通過定位衰減系數(shù)時間圖中的強白帶，可以很容易地識別梗塞。

 比較OMAG圖像還可觀察到MCA附近缺血腦組織中穿透血管的位移，特征為高衰減系數(shù)（> 3mm^-1）。圖5D顯示了短暫MCA閉塞后小ROI（圖5B中白框）中穿透血管的位移，其中兩個穿透小動脈（箭頭）出現(xiàn)逐漸移動，在OMAG圖像中顯示為左折疊。位移表示為軟腦膜分支與其貫穿血管間相對于基線的角度差。圖5E顯示5只小鼠的角度偏差平均超過約17度，而相對于ACA區(qū)域中的穿透血管，該偏差是邊緣性的（< 3度）。通過比較OMAG和衰減系數(shù)測量值得出的這一觀察結(jié)果表明，血管遷移與大腦缺血性損傷有關(guān)。

  圖5急性缺血性卒中期間小鼠大腦衰減系數(shù)反應(yīng)的皮質(zhì)組織散射變化。（A）短暫性MCA閉塞后大腦皮質(zhì)衰減系數(shù)的演變。（B）dMCAO后130min的OMAG圖像（紅色）和衰減系數(shù)圖（綠色）的疊加。（C）dMCAO后130min的TTC染色腦切片俯視圖。梗塞區(qū)域顯示為白色，正常組織顯示為紅色。箭頭指示類似軟腦膜動脈的血管分支（B中箭頭）。（D）小區(qū)域（B中白框）穿透血管（箭頭）相對于基線的位置變化。血管位移測量為穿透血管與其軟腦膜血管之間角度的變化。（E）每只小鼠血管位移的測量結(jié)果（avg ± std）。（F）B中白線處距表面350μm的截面皮質(zhì)組織中血液灌注（紅色）和衰減（綠色）的時間過程。


 結(jié)論

 本文使用一種多參數(shù)OCT方法，活體監(jiān)測了小鼠dMCAO模型中，缺血性卒中早期的腦組織損傷進(jìn)展和血流損傷。利用紅細(xì)胞和皮質(zhì)組織的固有光學(xué)散射特性提供了一系列內(nèi)源性對比圖像，提供了關(guān)于大腦脈管系統(tǒng)、血流速度、CBF和小鼠大腦組織特性變化的深度分辨信息。通過開放顱骨窗口，以2min間隔對dMCAO后的急性期（最初3小時）的持續(xù)檢測，揭示了該階段的腦血流動力學(xué)和皮質(zhì)組織散射變化之間的時空關(guān)系，為組織梗死發(fā)病機(jī)制、缺血損傷后半暗帶發(fā)展，以及相關(guān)的血流動力學(xué)事件提供了新的見解。此外這種監(jiān)測體內(nèi)多種生理事件的能力，將允許臨床前對缺血性腦損傷的潛在機(jī)制進(jìn)行深入研究，幫助制定適當(dāng)?shù)闹委煵呗詠砀纳迫毖�性卒中的結(jié)果。
 
 參考文獻(xiàn)：Choi, W. J. ,  Y. Li , and  R. K. Wang . "Monitoring Acute Stroke Progression: Multi-Parametric OCT Imaging of Cortical Perfusion, Flow, and Tissue Scattering in a Mouse Model of Permanent Focal Ischemia." IEEE Transactions on Medical Imaging PP.6(2019):1-1.