L-929（NCTCclone929）小鼠成纖維細胞的培養(yǎng)步驟及應(yīng)用

 　　一、細胞簡介：

　　細胞名稱：L-929（NCTCclone929）小鼠成纖維細胞

　　平臺編號:zl-056197

　　1948年三月建立了NCTCclone929(小鼠結(jié)締組織)，細胞系L的克隆。細胞系L是最早建立的連續(xù)培養(yǎng)細胞系之一，而clone929是最早的克隆株。從一只100日齡的雄性C3H/An小鼠的正常皮下疏松結(jié)締組織入脂肪組織中建立了親本細胞系L。第95代的細胞系L使用毛細管法分離單細胞建立了clone929。檢測發(fā)現(xiàn)鼠痘病毒陰性。

　　細胞特性

　　1）來源：組織：皮下結(jié)締組織；疏松結(jié)締組織及脂肪品系：C3H/An

　　2）形態(tài)：成纖維細胞，貼壁生長

　　3）含量：>1x106細胞數(shù)

　　4）規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

　　5)用途：僅供科研使用。

　　二．細胞的培養(yǎng)：

　　1）準備MEM培養(yǎng)基；馬血清10%；雙抗，1%。該細胞不能用胎牛血清培養(yǎng)。

　　2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

　　3）凍存液：90%馬血清或完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

　　三．細胞處理：

　　1）凍存細胞的復(fù)蘇：

　　將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

　　2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

　　對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：

　　1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

　　2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

　　3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。

　　3）細胞凍存:收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。

　　四、運輸和保存

　　干冰運輸及復(fù)蘇好存活細胞

　　（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

　�。�2）T25瓶復(fù)蘇的存活細胞常溫發(fā)貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

　　五、細胞接收后的處理

　　1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯(lián)系質(zhì)粒載體網(wǎng)。

　　2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態(tài)，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態(tài)的依據(jù)。

　　3）貼壁細胞：細胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8mL，放到細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。

　　4）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代。

　　六、應(yīng)用

　　用于羊棲菜多酚分離純化及對小鼠成纖維細胞抗紫外損傷影響研究

　　運用Folin-Ciocalteu比色法對羊棲菜多酚含量進行測定,并對該方法進行了優(yōu)化;然后利用酶輔助提取法對羊棲菜多酚進行提取,并對提取條件進行了優(yōu)化;采用大孔吸附樹脂法對羊棲菜多酚進行分離純化,并對純化條件進行了優(yōu)化以獲得高純度的羊棲菜多酚,另外測定了其體外抗氧化能力。

　　通過羊棲菜多酚對UV照射的小鼠成纖維細胞的保護作用、修復(fù)作用及細胞內(nèi)有關(guān)抗氧化酶的變化,研究了羊棲菜多酚對小鼠成纖維細胞抗紫外損傷的影響,為羊棲菜多酚在抗紫外損傷方面的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

　　為了明確羊棲菜多酚對UV照射的小鼠成纖維細胞抗紫外損傷的影響,研究了UV輻射劑量、羊棲菜多酚濃度及時間對細胞生長的影響,結(jié)果表明UV輻射劑量越大,小鼠成纖維細胞受到抑制越嚴重,UV輻射劑量為0.15J/cm2時最接近半致死劑量,作為后續(xù)實驗的UV照射劑量;羊棲菜多酚對小鼠成纖維細胞的保護作用隨多酚濃度的增大呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢,在羊棲菜多酚濃度為90μg/mL時保護作用最強。

　　從時間上看,加入羊棲菜多酚后培養(yǎng)4h再進行UV照射,保護作用最明顯,隨著時間的延長,保護作用開始下降。羊棲菜多酚對UV照射的小鼠成纖維細胞的修復(fù)作用,同樣隨著羊棲菜多酚濃度的增大呈先增強后減弱的趨勢,在80μg/mL濃度時修復(fù)作用達到最強。此外,羊棲菜多酚能增強UV照射的小鼠成纖維細胞內(nèi)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性,并降低丙二醛的含量。