動物疼痛模型：福爾馬林試驗(yàn)測試方法及注意事項(xiàng)

前言
一提起福爾馬林( formalin)，很多人都會想起開始學(xué)人體解剖學(xué)時那種刺鼻辣眼的氣味，可以想象注射福爾馬林造成的不適，這種刺激與前面提到的熱灼刺激不同，它是一種化學(xué)刺激，并且持續(xù)時間也較長，是一種慢性持續(xù)性疼痛模型的代表。Dubuisson和Dennis (1977)把福爾馬林試驗(yàn)的行為反應(yīng)分為4級：O級：注射福爾馬林的腳爪仍可壓在地板上并承受其體重；1級：動物把較輕的身體部分放在注射的腳爪上，并輕輕地壓在地板上；2級：動物把注射的腳爪抬離地面；3級：動物舔，咬或者搖晃注射過福爾馬林的腳爪。

福爾馬林注射可以引起兩期的疼痛感覺，這兩個期的區(qū)分除了時間上（第一期為注射后立即的疼痛持續(xù)到lOmin左右，第二期的疼痛則從注射后大約15 - 20min開始，持續(xù)60min以上），藥理學(xué)上也有明顯的不同，即非類固醇抗炎藥(nonstexoidal anti-inflammatory agents，NSAIDs)對第一期疼痛無效但可減弱第二期的疼痛，因而也說明福爾馬林性第二期疼痛是一種周圍炎癥性疼痛。這種疼痛一般認(rèn)為與中樞敏化作用有關(guān)，研究這類疼痛對于臨床上組織損傷造成的痛覺過敏機(jī)制探討極力重要。
 

一、實(shí)驗(yàn)材料

1、實(shí)驗(yàn)動物健康成年雄性小鼠(25 - 30g)或大鼠(250g)，分組飼養(yǎng)。

2、實(shí)驗(yàn)藥物生理鹽水（對照）和實(shí)驗(yàn)藥物。

3、5%福爾馬林（可用Signa的10%福爾馬林緩沖溶液，按I:l稀釋，這里lO%的溶液里含4%

的甲醛，因此，5%福爾馬林溶液就是2%的甲醛溶液）。

4、帶28.5G針頭的0.5ml（大鼠用）或30C針頭的50FLI（小鼠用）微量(Hamilton)注射器；帶27G（大鼠）或26C（小鼠）針頭的1.0ml注射器。

5、清潔的單個動物分裝盒（如帶蓋的鞋盒）。

6、手持計數(shù)器（一只動物一個），鐘表或計時器。

7、鏡子若干。

8、電子控制的定時亮光裝置。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1、從動物房取出實(shí)驗(yàn)動物，稱重后，用不退色標(biāo)記筆標(biāo)記要注射福爾馬林或生理鹽水的后爪，注意標(biāo)記腳爪的前后面，將對照組與實(shí)驗(yàn)組分開。

2、將動物放人試驗(yàn)時用的清潔的容器盒（鞋盒）內(nèi)，把鏡子放到容器盒的后面及側(cè)面，確保實(shí)驗(yàn)者能從不同的角度看到標(biāo)記的腳爪。讓動物適應(yīng)15 - 30min。

3、福爾馬林準(zhǔn)備大鼠實(shí)驗(yàn)用28.5G針頭的0.5ml注射器抽取5%福爾馬林50vl;小鼠實(shí)驗(yàn)用30G針頭的50FLl微量注射器抽取5%福爾馬林20L。

4、藥物注射用27G（大鼠）或26C（小鼠）的1.0ml注射器注射對照溶液或?qū)嶒?yàn)藥物，注射后給出至少10min時間，讓藥物在體內(nèi)作用后才可進(jìn)行下一步疼痛測試。不同的藥物可能需要不同的作用時間，也可在注射福爾馬林后注射，這主要用于研究第二期疼痛反應(yīng)。

5、福爾馬林注射將動物從容器盒中取出放到桌上，用一只手輕輕抓住動物的身體軀干，另一手抓住尾巴，讓動物“坐”在桌上便于拉伸其后爪。把尾巴放到抓身體的手中，空出手來把標(biāo)記的腳爪拉出來，然后拿取裝有福爾馬林的微注射器。大鼠注射可以將溶液注射到腳拇指背上踝下方的皮下即可；而小鼠注射則要將福爾馬林溶液注射到腳底爪的中央皮。

6、注射福爾馬林后，立即將動物放回到容器內(nèi)并開始計時，這是疼痛的第一期反應(yīng)時間。其余的動物也依次類似進(jìn)行注射，然后開始分別計時。

7、一般在福爾馬林注射后最初的反應(yīng)在大小鼠是不一樣的，即大鼠出現(xiàn)的是爪趾的抽縮( flich-ing)，而小鼠則主要是舔注射的部位，因此，必須觀察第一只注射大鼠后爪在15。內(nèi)抽縮的次數(shù)，然后依次記錄其他3只大鼠的抽縮次數(shù)；完成第4只后又從第1只大鼠開始，這樣循環(huán)計算共10min。小鼠的觀察是每隔5min觀察Imin，然后隔1min注射下一只小鼠，因而可以注射4只小鼠，這樣每間隔5min觀察1只小鼠，共計40min，小鼠的觀察主要計算其舔腳爪的時間。

8、記錄疼痛第一期內(nèi)大鼠總的后抓抽縮次數(shù)或小鼠的舔腳趾的總時間。為了有效利用時間，可以在第一期于第二期之間準(zhǔn)備下一組動物的稱重，標(biāo)記及適應(yīng)等。

9、大鼠福爾馬林注射后30min即可開始計算第二期的抽縮次數(shù)，一般計算20min；小鼠注射后10- 40min可以算第二期開始，也同第一期一樣計算其舔爪趾的總時間。

10、重復(fù)上述步驟，在所有實(shí)驗(yàn)動物完成測試后（一般每組至少8個數(shù)據(jù)），分組將其結(jié)果平均并作統(tǒng)計學(xué)處理。

三、注意事項(xiàng)

1、為了減少抓取動物的壓抑( stress)行為，可以在實(shí)驗(yàn)前一到兩天開始訓(xùn)練抓取動物，這樣在注射福爾馬林時就可避免壓抑造成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的波動。

2、試驗(yàn)動物太小(如< 200g)、福爾馬林注射不當(dāng)或檢測方法不對都可造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差，因此，應(yīng)選大動物、標(biāo)準(zhǔn)注射程序和有效的檢驗(yàn)方法。

3、福爾馬林疼痛的第二期可能變異較大，預(yù)實(shí)驗(yàn)階段可以計算第二期的整個階段(從注射后第20 - 60min)，這樣知道在大概時間段內(nèi)反應(yīng)的高峰期后即可有選擇地對其他動物進(jìn)行重點(diǎn)時間段計算。

4、福爾馬林的濃度一般定為5%，但是有些藥物（知嗎啡2mg/kg）可能因這種濃度的刺激太強(qiáng)而沒有作用，但是這個藥物的劑量足以完全消除1%福爾馬林的反應(yīng)，因而為了測試不同藥物對疼痛反應(yīng)的影響，必須用不同濃度的福爾馬林注射到腳爪上。