Cytena單細(xì)胞打印機(jī)助力新冠病毒棘突蛋白的開發(fā)

自新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）爆發(fā)以來，截至目前為止全球感染新型冠狀病毒的病例一億八千多萬，死亡病例三百九十多萬，我國感染病例亦有十一萬多，現(xiàn)每日仍有病例不斷報出，感染病例也不斷上升。此次大流行由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）所引起的一種新發(fā)型急性呼吸道傳染病，疫情幾乎蔓延至所有的國家，給全球社會經(jīng)濟(jì)帶來了極大災(zāi)難，也成為了目前全球最大的公共衛(wèi)生事件。

因此，認(rèn)識和理解COVID-19感染途徑和發(fā)病機(jī)制對其防控和治療具有重要意義。作為新平臺，單細(xì)胞技術(shù)的成熟在整個生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用催生了許多重要的生物學(xué)發(fā)現(xiàn)，也意味著在臨床研究上會有一批新的突破，所以單細(xì)胞分離篩選在SARS-CoV-2研究中起到尤為重要的作用。

新冠病毒的起源發(fā)展

自20世紀(jì)30年代末以來，人們就知道了動物冠狀病毒，最近的研究將Human coronaviruses (HCoVs）的進(jìn)化與加速的城市化和家禽養(yǎng)殖聯(lián)系起來；這些做法允許頻繁的物種交換和簡化物種屏障的跨越，研究人員通過研究SARS-CoV-2和相關(guān)sarbecovirus （SARS-CoV-2屬于蝙蝠和穿山甲病毒的病毒群）的突變過程發(fā)現(xiàn)了相當(dāng)顯著的變化，早在1983年，有證據(jù)強(qiáng)烈表明單峰駱駝是MERS CoV的重要宿主；據(jù)預(yù)測，這種祖?zhèn)鞑《緯�從蝙蝠身上跨越物種屏障，進(jìn)入單峰駱駝體內(nèi)。后來，穿山甲被認(rèn)為是SARS-CoV-2的潛在中間宿主，因?yàn)樗�與穿山甲中的CoV具有99%的遺傳同源性；但它們都是在SARS-CoV-2出現(xiàn)在人類之前。這也說明，許多冠狀病毒具有“通才”的特性且在宿主之間跳躍能力明顯，而這一特性使得冠狀病毒可能在傳染給人類之前就已經(jīng)在蝙蝠中得到進(jìn)化了^[1]。

圖1. 冠狀病毒的起源和向人類的傳播途徑

 

大流行的人類冠狀病毒的棘突蛋白對于其進(jìn)入人體細(xì)胞至關(guān)重要。事實(shí)上，大多數(shù)針對嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合冠狀病毒 2 (SARS-CoV-2) 的中和抗體是針對病毒表面暴露的棘突蛋白，使其成為疫苗和診斷測試的首選抗原。在當(dāng)前大流行的背景下，全球?qū)�棘突蛋白的需求迅速增加，每年可能超過數(shù)百克至公斤。冠狀病毒棘突是高度糖基化的同源三聚體復(fù)合物，具有固有的結(jié)構(gòu)靈活性和不穩(wěn)定性�？芍圃煨圆瞵F(xiàn)威脅到這些蛋白質(zhì)用于疫苗和診斷測試的可用性。所以尋求一種能夠穩(wěn)定生產(chǎn)三聚體棘突蛋白(Trimeric spike protein，S蛋白）的工藝尤為重要。

 

SARS-CoV-2  S蛋白的設(shè)計(jì)

SARS-CoV-2  S蛋白的編碼DNA的密碼子經(jīng)過優(yōu)化，一共設(shè)計(jì)了11個DNA結(jié)構(gòu)體（圖2），并由ATUM公司合成。添加了一個功能性IgG先導(dǎo)序列來介導(dǎo)有效的信號肽切割。添加編碼組氨酸（8-聚體）的DNA用于羧基末端表達(dá)。如前所述，furin裂解位點(diǎn)RRAR突變?yōu)榉枪δ苄�。在三聚體設(shè)計(jì)中，將跨膜區(qū)和C端細(xì)胞內(nèi)的尾端去除，用一個T4折疊子序列取代。對于RBD片段（aa319-541），添加了IgG leader和His標(biāo)簽序列。由于攜帶D614G氨基酸變化的SARS-CoV-2變異體的廣泛出現(xiàn)，本研究中也包括了這種棘突蛋白變異 。
 

圖 2. Schematic representation of SARS-CoV-2 spike protein designs.

 

單克隆細(xì)胞株的篩選和三聚體棘突蛋白表達(dá)

采用CHO4Tx的轉(zhuǎn)染試劑，在無動物來源的培養(yǎng)基中，將包含SARS-CoV-2 棘突蛋白的DNA序列的pXLG-6載體轉(zhuǎn)染CHOExpress^TM細(xì)胞。該載體包括用于嘌呤霉素抗性標(biāo)記物的表達(dá)盒。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，對于wuhan突變毒株，采用德國 cytena 的 f.sight 單細(xì)胞打印機(jī)篩選單克隆細(xì)胞株。將高水平表達(dá)的三聚體S蛋白和RDB單體的細(xì)胞株擴(kuò)增并凍存。RBD棘突片段的重組細(xì)胞系和三聚體S蛋白的克隆細(xì)胞系在優(yōu)化的補(bǔ)料分批工藝中，以0.2-，10-和50-L的生物反應(yīng)器中放大培養(yǎng)。

從300個單克隆衍生的細(xì)胞群中，挑選出三聚體棘突（trimeric spike）和受體結(jié)合域（RBD）表達(dá)水平最高的細(xì)胞群進(jìn)行擴(kuò)增，并開發(fā)了補(bǔ)料分批生產(chǎn)工藝。生產(chǎn)過程逐步擴(kuò)大到200mL搖瓶、10L和40L攪拌槽生物反應(yīng)體系�；罴�(xì)胞密度（VCD）和存活率可保持高達(dá)10天（圖3）。觀察到三聚體棘突蛋白和RDB單體在各種培養(yǎng)規(guī)格下最終收獲滴度均為數(shù)百毫克/升。
 

Figure3. Cell culture scale-up performance in shake flasks and bioreactors.

三聚體棘突（a）和RBD（b）的活細(xì)胞密度（細(xì)胞/mL）和活細(xì)胞（%）。

 

SARS-CoV-2的棘突蛋白對SARS-CoV-2感染的抑制作用

將SARS-CoV-2病毒與連續(xù)稀釋的RBD或三聚體棘突混合，并將混合物接種到Vero E6細(xì)胞上。48h后發(fā)現(xiàn)RBD棘突片段和三聚體棘突的存在減少了Vero E6細(xì)胞的感染。表明CHO產(chǎn)生的三聚體棘突和RBD能夠與SARS-CoV-2競爭與宿主細(xì)胞的結(jié)合。在614D（武漢）和D614G三聚體棘突變體之間未觀察到差異^[2]。
 

圖4. CHO產(chǎn)生的三聚體棘突和 RBD可抑制SARS-CoV-2感染

（a）三聚體棘突和RBD對Vero E6細(xì)胞感染的抑制作用，

病毒核衣殼抗原染色（紅色），細(xì)胞核染色（藍(lán)色）；并對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（b）。

 

SARS-CoV-2棘突蛋白檢測抗體的敏感性和特異性

我們特別選擇了一組2019冠狀病毒疾病血清樣本，這些樣本涵蓋了大量SARS-CoV-2特異性抗體濃度。通過對三聚體棘突蛋白和RBD蛋白用于血清學(xué)分析中檢測SARS-CoV-2特異性IgG。發(fā)現(xiàn)新冠病毒樣本的中值信號強(qiáng)度比對照樣本高400倍以上（圖5a）。統(tǒng)計(jì)分析顯示，S1單體和兩種RBD的ROC之間沒有差異，武漢和D614G三聚體棘突之間也沒有差異。此外，我們的結(jié)果表明，CHO產(chǎn)生的三聚體棘突比S1單體和RBD具有更高的診斷特異性和敏感性。

圖 5. CHO產(chǎn)生的三聚體棘突具有更高的診斷特異性和敏感性

（a）在癥狀出現(xiàn)的第4-40天收集的對照血清（n=151）

和 2019冠狀病毒疾病血清（n=72）進(jìn)行了測試，

并比較了免疫球蛋白G的濃度。（b）用 ROC分析（a）中檢測的血清。

 

Cytena單細(xì)胞打印機(jī)溫和篩選的原理保證了CHO具有較高的活性，為下游的擴(kuò)展生產(chǎn)工藝奠定了基礎(chǔ)，以提供足夠數(shù)量的具有哺乳動物型糖基化的三聚體SARS-CoV-2棘突蛋白。功能分析表明，三聚體SARS-CoV-2棘突蛋白能夠有效地阻斷病毒的傳染性。此外，三聚體棘突對SARS-CoV-2特異性IgG的診斷性能超過RDB和單體S1蛋白。
 

參考文獻(xiàn)：

[1].Kirtipal N ,  Bharadwaj S ,  Kang S G . From SARS to SARS-CoV-2, insights on structure, pathogenicity and immunity aspects of pandemic human coronaviruses[J]. Infection Genetics and Evolution, 2020, 85:104502.[1] Kirtipal N ,  Bharadwaj S ,  Kang S G . From SARS to SARS-CoV-2, insights on structure, pathogenicity and immunity aspects of pandemic human coronaviruses[J]. Infection Genetics and Evolution, 2020, 85:104502.

[2]. Pino P ,  Kint J ,  Kiseljak D , et al. Trimeric SARS-CoV-2 Spike Proteins Produced from CHO Cells in Bioreactors Are High-Quality Antigens[J]. Processes, 2020, 8(12).Pino P ,  Kint J ,  Kiseljak D , et al. Trimeric SARS-CoV-2 Spike Proteins Produced from CHO Cells in Bioreactors Are High-Quality Antigens[J]. Processes, 2020, 8(12).
 

關(guān)于Cytena公司                                                                               

Cytena公司潛心研究單細(xì)胞打印機(jī)技術(shù)多年，不斷升級設(shè)備功能，以一貫溫和的分選原理、更加快速的分選效率、更加簡易的操作步驟，助力抗體、細(xì)胞治療、基因治療、干細(xì)胞等研究領(lǐng)域的客戶快速搭建單細(xì)胞篩選平臺。艾貝泰生物科技有限公司作為Cytena的單細(xì)胞打印機(jī)總代理商，為您提供最優(yōu)質(zhì)的售前售后服務(wù)。

咨詢請聯(lián)系👇👇👇

電話：400-8816-128

郵箱：biotech@applitechpharma.com