Microfluidics-Transwell應(yīng)用腸上皮三維形態(tài)發(fā)生的基礎(chǔ)研究

本期推送為大家?guī)��?lái)一篇采用Microfluidics-Transwell培養(yǎng)3D人腸道上皮細(xì)胞的研究論文，一起來(lái)看看吧。

文章信息 .

文章題目：3D in vitro morphogenesis of human intestinal epithelium in a gut-on-a-chip or a hybrid chipwith a cell culture insert.

期刊：Natrue Protocols

影響因子：13.491

發(fā)表日期：2022年2月2日

DOI：10.1038/s41596-021-00674-3

【研究概述】

文章介紹了兩款仿生腸道芯片：Gut-on-a-chip腸道芯片和Transwell-insertable chip混合芯片，可以誘導(dǎo)自發(fā)的腸道上皮3D形態(tài)發(fā)生，具有良好的生理功能和生物力學(xué)特征。這種仿生腸道芯片結(jié)合了微流控技術(shù)，可以誘導(dǎo)Caco-2或腸道類器官上皮細(xì)胞發(fā)生，通過(guò)控制基底外側(cè)液體流動(dòng)實(shí)現(xiàn)功能性腸道微結(jié)構(gòu)的再生。其中，Transwell-insertable chip混合芯片構(gòu)造更簡(jiǎn)單，使用方便，可插入的Transwell可以獨(dú)立培養(yǎng)腸道上皮細(xì)胞，該芯片搭配微流控系統(tǒng)可以為體外形態(tài)發(fā)生提供生理學(xué)相關(guān)的剪切應(yīng)力和機(jī)械運(yùn)動(dòng)，不需要復(fù)雜的細(xì)胞工程或操作，體現(xiàn)出比其他現(xiàn)有技術(shù)更多的優(yōu)勢(shì)。Transwell-insertable chip混合芯片提供了一種體外3D腸上皮細(xì)胞再生方法，對(duì)生物醫(yī)學(xué)研究界將產(chǎn)生廣泛影響，可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和藥物毒性和藥理學(xué)等研究領(lǐng)域。

Transwell-insertable chip混合芯片結(jié)構(gòu)：

圖1. Transwell-insertable chip混合芯片結(jié)構(gòu)示意圖

Transwell-insertable chip混合芯片的結(jié)構(gòu)如圖1所示，由Transwell插件、微通道層和玻璃片組成，其中微通道分別由流入口和流出口與微流控系統(tǒng)連接。將獨(dú)立制備的用于培養(yǎng)單層腸上皮細(xì)胞的Transwell插件插入混合芯片中，培養(yǎng)基通過(guò)建立在Transwell插入物上的細(xì)胞層下面的微通道灌注，以誘導(dǎo)腸三維形態(tài)發(fā)生。

研究中混合芯片的實(shí)驗(yàn)方案步驟可簡(jiǎn)單總結(jié)為以下五步：

🔹 Transwell-insertable chip混合芯片的制備；

🔹 腸上皮細(xì)胞(Caco-2細(xì)胞或人腸類器官)的制備；

🔹 混合芯片上培養(yǎng)腸道上皮細(xì)胞；

🔹 體外三維形態(tài)發(fā)生的誘導(dǎo)；

🔹 三維上皮微結(jié)構(gòu)的表征。

Transwell-insertable chip混合芯片腸上皮細(xì)胞3D培養(yǎng)特征：

圖2. Transwell-insertable chip混合芯片中腸上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生特征圖

如圖2 Transwell-insertable chip混合芯片中腸上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生特征所示，混合芯片中誘導(dǎo)腸道形態(tài)發(fā)生的流程：

1）將分離的上皮細(xì)胞放入準(zhǔn)備好的Transwell插件中；

2）細(xì)胞被播種并附著在Transwell插件的聚酯膜上，所有細(xì)胞都在靜態(tài)條件下培養(yǎng)(TW培養(yǎng))；

3）7天后，將含有單層上皮細(xì)胞的單個(gè)Transwell插入物整合到混合芯片中并接入基底外側(cè)流動(dòng)(flow, BL)；

4）最終生成三維上皮細(xì)胞層(Morphogenesis)。

圖b所示混合芯片(左圖)誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞的類器官三維形態(tài)發(fā)生，在不同的z軸位置(上、中、下；見(jiàn)右側(cè)示意圖對(duì)應(yīng)的虛線)顯示出明顯的形態(tài)特征。其中青色為肌動(dòng)蛋白，灰色為細(xì)胞核。圖c為腸上皮細(xì)胞在靜態(tài)Transwell中培養(yǎng)(TW;左上角小圖)和在混合芯片中誘導(dǎo)培養(yǎng)后（Hybrid Chip；下方大圖）的熒光共聚焦顯微圖，可以清晰觀察到混合芯片中產(chǎn)生了三維形態(tài)；XZ視角橫切視圖(右上角小圖)也顯示混合芯片培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞發(fā)生了三維形態(tài)的改變，而靜態(tài)Transwell中培養(yǎng)得腸上皮細(xì)胞未見(jiàn)形態(tài)變化。

Transwell-insertable chip混合芯片優(yōu)勢(shì)分析：

1. 研究中提及外源性添加Wnt拮抗劑到芯片上會(huì)抑制三維形態(tài)發(fā)生或破壞預(yù)結(jié)構(gòu)的三維上皮層，提示了在三維培養(yǎng)過(guò)程中的拮抗力與體外腸道形態(tài)發(fā)生有關(guān)。因此，利用微流控系統(tǒng)通過(guò)主動(dòng)清洗或擴(kuò)散基底外側(cè)培養(yǎng)液中的形態(tài)拮抗劑，可以促進(jìn)腸上皮細(xì)胞三維形態(tài)形成。

2. 混合芯片優(yōu)于體內(nèi)動(dòng)物模型以及其他傳統(tǒng)的靜態(tài)二維細(xì)胞培養(yǎng)模型。動(dòng)物研究對(duì)勞動(dòng)力和成本要求高且存在動(dòng)物倫理問(wèn)題。最重要的是，遺傳背景差異使得動(dòng)物模型不能準(zhǔn)確地替代模擬人的組織器官的發(fā)生和生理代謝等過(guò)程�；旌闲酒�的細(xì)胞可以是病人組織樣本來(lái)源，盡可能消除物種間差異。此外，混合芯片是微流控3D培養(yǎng)，相比傳統(tǒng)靜態(tài)二維培養(yǎng)更加真實(shí)地模擬體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的生理環(huán)境對(duì)細(xì)胞的影響

3. 混合芯片中提供了自發(fā)的腸道形態(tài)發(fā)生和生理相關(guān)的剪切應(yīng)力，可以模擬腸道蠕動(dòng)的生物力學(xué)，以及獨(dú)立并可反復(fù)操作的Transwell可插入式頂室和基底外側(cè)室。相比較與腸道干細(xì)胞培養(yǎng)得到的封閉腸道類器官，混合芯片可以方便快捷地引入微生物細(xì)胞或外源抗原，進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)分析或宿主-微生物組共培養(yǎng)；相比于傳統(tǒng)的水凝膠支架類器官，混合芯片可在微流控系統(tǒng)的控制下為整個(gè)微環(huán)境提供動(dòng)態(tài)的腔內(nèi)或間質(zhì)流動(dòng)，和生理功能所需的流體剪切應(yīng)力，準(zhǔn)確反映活躍的體內(nèi)生物力學(xué)。同時(shí)，傳統(tǒng)的類器官預(yù)構(gòu)造的三維水凝膠支架可能會(huì)阻礙腸上皮細(xì)胞的自發(fā)形態(tài)發(fā)生過(guò)程。

Transwell-insertable chip混合芯片應(yīng)用前景分析：

1. 為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等基礎(chǔ)研究領(lǐng)域提供新的工具和手段�；旌闲酒�具有可重復(fù)性和系統(tǒng)穩(wěn)定性，可以研究腸道發(fā)育、再生或穩(wěn)態(tài)過(guò)程中細(xì)胞信號(hào)動(dòng)力學(xué)；可以研究諾如病毒、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)、艱難梭狀芽胞桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌或霍亂弧菌等各種感染性病原體下的疾病病理和發(fā)病機(jī)制；允許縱向共培養(yǎng)，以及隨后評(píng)估宿主防御、免疫反應(yīng)和胃腸道(GI)中病原體相關(guān)的損傷修復(fù)；使用患者的活檢或干細(xì)胞來(lái)源的腸類器官制備三維腸上皮層時(shí)，可以模擬腎炎或腸易激綜合征；可以考慮在包含三維腸絨毛-隱窩微結(jié)構(gòu)中添加與疾病相關(guān)的其他細(xì)胞類型，以更好地模擬疾病環(huán)境的復(fù)雜性。

2. 混合芯片具有可組裝的Transwell室，易于拆卸和操作�？梢栽跊](méi)有切片過(guò)程的情況下固定和可視化，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究和高分辨率或超分辨率成像，以繪制三維上皮微環(huán)境中基因和蛋白質(zhì)對(duì)微生物或免疫刺激的時(shí)空動(dòng)態(tài)響應(yīng)；同時(shí)經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)改造后可配合24、96或384孔板，加上微流控系統(tǒng)可以連續(xù)補(bǔ)充基底外側(cè)區(qū)室，適合在制藥、生物醫(yī)學(xué)或食品工業(yè)中開(kāi)發(fā)高通量篩選或驗(yàn)證平臺(tái)。

【總結(jié)】

全新升級(jí)的Microfluidics-Transwell系統(tǒng)在以下幾個(gè)方面盡顯優(yōu)勢(shì)：

☑ 可以精確控制下室培養(yǎng)液的種類、因子含量以及給液速度，盡可能模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)和流體環(huán)境，滿足多種實(shí)驗(yàn)需求；

☑ 可以精確定量下室培養(yǎng)液成分變化，檢測(cè)上下層培養(yǎng)細(xì)胞分泌的細(xì)胞信號(hào)物質(zhì)，更準(zhǔn)確地研究細(xì)胞間聯(lián)系；

☑ 可以再現(xiàn)流體環(huán)境并且更加真實(shí)地模擬腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程（腫瘤細(xì)胞內(nèi)滲、進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)、腫瘤細(xì)胞外滲、形成轉(zhuǎn)移灶等）。

SBC中心實(shí)驗(yàn)室配備全新升級(jí)的Microfluidics-Transwell系統(tǒng)，為您提供新的科研思路，助力解決科研難題，讓您在科研的道路上暢通前行！