基于EAD碎裂的生物制品關(guān)鍵質(zhì)量屬性的MAM策略

Multi-Attribute Method(MAM)是基于質(zhì)譜的一種自動(dòng)化分析方法，可以實(shí)現(xiàn)在生物制品研發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程中，用質(zhì)譜方法一次進(jìn)樣同時(shí)監(jiān)測(cè)多個(gè)產(chǎn)品質(zhì)量屬性（PQA），從而將質(zhì)譜這一傳統(tǒng)意義上用于研發(fā)的分析技術(shù)，應(yīng)用于產(chǎn)品放行。如何可信地表征生物制品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（PQA）一直是生物制藥企業(yè)MAM技術(shù)的核心問(wèn)題�；�于碰撞誘導(dǎo)解離（CID）的MAM工作流程通常需要結(jié)合互補(bǔ)的MS/MS技術(shù)用于鑒定氨基酸同分異構(gòu)體等PQA。傳統(tǒng)的ExD碎裂受限于過(guò)長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間和低靈敏度，無(wú)法在單針進(jìn)樣的情況下實(shí)現(xiàn)相關(guān)PQA的MAM分析流程，而基于全新電子活化解離（EAD）的MAM技術(shù)，單針進(jìn)樣即可準(zhǔn)確，快速，靈敏且可重現(xiàn)地分析生物制品的PQA，如氨基酸同分異構(gòu)體等。
 

多質(zhì)量屬性監(jiān)測(cè)MAM：

MAM是一種功能強(qiáng)大的LC-MS方法，用于同時(shí)監(jiān)測(cè)和量化生物制品的多個(gè)產(chǎn)品質(zhì)量屬性（PQA）或關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）。傳統(tǒng)意義上，基于CID的MS/MS被用作鑒定的第一步，然后使用基于MS或MS和MS/MS工作流進(jìn)行量化。然而，基于CID的MS/MS方法不可能對(duì)發(fā)生脫酰胺化的肽段進(jìn)行全序列確認(rèn)，包括區(qū)分亮氨酸與異亮氨酸、天冬氨酸與異天冬氨酸（Asp vs. isoAsp）以及脆弱修飾（如糖基化）的定位。因此，基于CID的鑒定工作流程必須依賴(lài)于互補(bǔ)的MS/MS技術(shù)，在對(duì)所選物種進(jìn)行量化之前，在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中使用其他更先進(jìn)的儀器。我們可以使用基于EAD的平臺(tái)方法5,6解決這一挑戰(zhàn)，該方法能夠在單針進(jìn)樣中使用MAM對(duì)PQA進(jìn)行可靠、準(zhǔn)確的識(shí)別、量化和監(jiān)測(cè)（圖1）。
 

圖1：基于EAD的MAM工作流程。ZenoTOF 7600系統(tǒng)提供的EAD平臺(tái)方法1-4為序列確認(rèn)和翻譯后修飾（PTM）的識(shí)別提供了可靠的肽圖結(jié)果，并能夠區(qū)氨基酸分異構(gòu)體。這是MAM獲得這些PQA和CQA準(zhǔn)確量化結(jié)果的先決條件。用于肽圖分析的Biologics Explorer軟件和用于PQA和CQA量化的符合合規(guī)要求的SCIEX OS軟件的結(jié)合，使基于EAD的MAM工作流成為一個(gè)簡(jiǎn)化的單針進(jìn)樣過(guò)程。
 
 
1  可靠的PQA識(shí)別和氨基酸異構(gòu)體區(qū)分：?jiǎn)吾樳M(jìn)樣的EAD平臺(tái)方法可以區(qū)分氨基酸異構(gòu)體和翻譯后修飾（PTM），這對(duì)傳統(tǒng)表征和MAM方法具有挑戰(zhàn)性。

2  簡(jiǎn)化的數(shù)據(jù)流：可定制的PQA列表將Biologics Explorer軟件中的肽圖結(jié)果與符合合規(guī)性要求的SCIEX OS軟件將PQA量化和監(jiān)測(cè)關(guān)聯(lián)起來(lái)。

3  強(qiáng)大的肽圖軟件：Biologics Explorer軟件為肽圖分析和PQA選擇提供了強(qiáng)大的算法和優(yōu)化的工作流。

4  合規(guī)性：PQA量化和監(jiān)控。
 
   

圖2：Biologics Explorer軟件結(jié)合合規(guī)軟件SCIEX OS的MAM工作流。在此流程中，使用Biologics Explorer軟件從EAD DDA數(shù)據(jù)的肽圖中非�？尚诺卮_定了mAb的PQA。選擇感興趣的PQA并將其導(dǎo)出到.txt文件，然后導(dǎo)入到使用SCIEX OS軟件的分析模塊創(chuàng)建的處理方法中。峰面積積分使用MQ4算法執(zhí)行，然后創(chuàng)建用于相對(duì)PQA量化和監(jiān)測(cè)的自定義模板。報(bào)告功能提供了許多用于自定義和選擇不同文件格式的選項(xiàng)，例如word文檔和pdf文檔。
 
   
分析模塊提供了充分的靈活性，可以在處理方法中構(gòu)建自定義公式，用于計(jì)算PQA的豐度百分比7-8。圖3顯示了VVSV肽段PQA的量化結(jié)果，該結(jié)果是通過(guò)將帶有自定義公式的處理方法應(yīng)用于NISTmAb對(duì)照品的3次重復(fù)進(jìn)樣，并持續(xù)給予加熱壓力而獲得。考慮到定量結(jié)果的嚴(yán)格性，計(jì)算的百分比豐度在CID和EAD方法中均具有高度的重現(xiàn)性（%CV<10%）。
 

圖3：SCIEX OS軟件的分析模塊對(duì)PQA的相對(duì)定量結(jié)果，圖標(biāo)列出了以NISTmAb為對(duì)照，熱壓情況下三次進(jìn)樣VVSV肽段的異構(gòu)化和脫酰胺化峰面積的豐度百分比。
 
 
從0天到10天持續(xù)給與加熱壓力，脫酰胺化程度Asp和不同isoAsp形式的百分比值顯著增加。為了快速檢查結(jié)果，SCIEX OS軟件提供了用于可視化的度量圖（圖4A），或者可以使用其他繪圖選項(xiàng)在Excel中導(dǎo)出和處理結(jié)果（圖4B）。
  圖4：MAM的可視化結(jié)果。圖（A）和圖（B）都展示了重復(fù)進(jìn)樣的PQA量化的重現(xiàn)性，以及MAM工作流監(jiān)測(cè)PQA豐度百分比的能力，以用于不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)研究。
 
 
1.PQA的可靠識(shí)別及氨基酸異構(gòu)體的明確區(qū)分對(duì)于MAM的成功實(shí)施至關(guān)重要。

2.通過(guò)基于EAD碎裂的DDA采集方法，可以區(qū)分脫酰胺作用中的Asp和isoAsp異構(gòu)體，脫酰胺化是PQA的一個(gè)重要類(lèi)別，可能影響藥物的療效和安全性。

3.通過(guò)現(xiàn)成的工作流程模板，Biologics Explorer軟件實(shí)現(xiàn)了高效識(shí)別，該模板提供了可靠的肽圖結(jié)果和可視化工具，能夠?qū)�PQA列表導(dǎo)出到SCIEX OS軟件進(jìn)行量化。

4.符合法規(guī)要求的SCIEX OS軟件為PQA的峰提取和相對(duì)定量提供了強(qiáng)大的算法和工具。

5.通過(guò)Biologics Explorer軟件和合規(guī)的SCIEX OS軟件之間的數(shù)據(jù)流，實(shí)現(xiàn)了從識(shí)別到量化的有效MAM工作流。
   
 
References
1. Takashi Baba, Pavel Ryumin, Eva Duchoslav et al. (2021) Dissociation of biomolecules by an intense low-energy electron beam in a high sensitivity time-of-flight mass spectrometer. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 32(8):1964-1975.
2. Comprehensive peptide mapping of biopharmaceuticals utilizing electron activated dissociation (EAD). SCIEX technical note, RUO-MKT-02-12639-B.
3. A new electron activated dissociation (EAD) approach for comprehensive glycopeptide analysis of therapeutic proteins. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-12980-A.
4. An evaluation of single injection platform method for advanced characterization of protein therapeutics using electron activation dissociation (EAD). SCIEX technical note, RUO-MKT-02-13965-A.
5. Differentiation of aspartic and isoaspartic acid using electron activated dissociation (EAD). SCIEX technical note, RUO-MKT-02-12550-B.
6. Differentiation of leucine and isoleucine using electron activated dissociation (EAD). SCIEX technical note, RUO-MKT-02-12605-B.
7. Compliant attribute monitoring for biopharmaceutical product quality attributes employing intact mass analysis. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-11314-A.
8. A liability study on oxidation using SCIEX OS software 1.7 for intact MAM. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-11551-A.