CNTest中藥行業(yè)黃曲霉毒素免疫親和柱使用操作說明書

CNtest黃曲霉毒素總量免疫親和柱-中藥專用
       （產(chǎn)品編號(hào)：QHZ103-ZY）    
使用對(duì)象
CNtest免疫親和柱由中檢維康完全自主開發(fā)的系列產(chǎn)品，廣泛地應(yīng)用于中藥、糧食、食品、飼料、堅(jiān)果、植物油、調(diào)味品和酒類等樣品的檢測(cè)，該方法具有操作簡單、準(zhǔn)確性高，靈敏度高等特點(diǎn)。
CNtest黃曲霉毒素免疫親和柱-中藥專用柱是根據(jù)《中國藥典2020版-2351真菌毒素測(cè)定法》獨(dú)立開發(fā)的產(chǎn)品，它適用于藥典中黃曲霉毒素親和柱檢測(cè)方法。同時(shí)我們對(duì)部分檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化，為大家提供更好的解決方案。
 
原理
樣品經(jīng)提取液提取、過濾、稀釋，然后通過鍵合有黃曲霉毒素特殊抗體的免疫親和柱。此時(shí)，黃曲霉毒素被親和柱中的抗體特異性的吸附，用水或緩沖液將免疫親和柱上的雜質(zhì)除去，然后用甲醇使抗體變性，從而將黃曲霉毒素從親和柱上洗脫下來。最后，用HPLC或熒光計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)。
儲(chǔ)存條件
該親和柱保存在2-8 °C條件下，絕對(duì)不能冷凍，保質(zhì)期為18個(gè)月。建議在室溫（18-30°C）下使用。
實(shí)驗(yàn)溶液制備
1)      提取液，甲醇/水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水，混合均勻。
2)      提取液，乙腈/水（9+1）：取90mL乙腈加10mL水，混合均勻。
3)      HPLC流動(dòng)相，甲醇-乙腈-水（20+18+62，v/v）：取200mL甲醇、180mL乙腈、620mL水，混合均勻，用0.22微米的尼龍篩過濾。
4)      標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取黃曲霉毒素混標(biāo)（46304-U，B1和G1為1.0ug/mL,B2和G2為0.3ug/mL），甲醇為稀釋液，配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液。例如：取100uL標(biāo)準(zhǔn)品原液于10mL容量瓶中，用甲醇定容至10mL，那么，黃曲霉毒素B1和G1為10ng/mL，黃曲霉毒素B2和G2為3ng/mL.
    注：配制好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液2-8℃冷藏保存有效期為24h。
5)      淋洗緩沖液，pH 7.0 PBS溶液：稱取8.0g氯化鈉，1.2g磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，最后用純水稀釋至1000mL。
或 量取100mL  10X Clover淋洗緩沖液（貨號(hào)：C3007）用900mL純水稀釋，混勻。
6)      0.5%的吐溫/PBS：將5.0mL吐溫-20加入到1L pH 7.0 PBS溶液中，混勻。
或 量取100mL  10X 0.5%的吐溫-20/pH7.0 PBS（貨號(hào)：C3008）用900mL純水稀釋，混勻。
 
液相色譜條件
    色譜柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）
流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（20+18+62，v/v）
流速：0.8mL/min
檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長360nm,發(fā)射波長450nm
進(jìn)樣體積：20~100uL
光化學(xué)衍生化系統(tǒng)：光化學(xué)衍生器（254nm）
 
分析步驟
1  2020版-2351真菌毒素測(cè)定法-黃曲霉毒素測(cè)定法第一法和第二法：
1.1樣品提取及稀釋：
準(zhǔn)確稱取試樣15.0g于均質(zhì)杯中，加入3g氯化鈉，準(zhǔn)確加入75.0mL甲醇-水（7+3），以均質(zhì)器高速攪拌提取2min（攪拌速度大于11000r/min）。普通濾紙過濾或4000RPM離心5min，準(zhǔn)確移取15.0mL濾液或上清液置于50mL容量瓶中，用純水稀釋至50mL, 混勻。用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，量取20mL濾液備用；或 4000RPM離心10min，量取20ml上清液備用。
1.2樣品的凈化
     將免疫親和柱連接于20.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確量取20mL處理好的樣品濾液或上清液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約3mL/min（1滴/秒）流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體。以3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子2次（必要時(shí)可以用淋洗緩沖液10mL淋洗，再用水10mL淋洗），棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入1.0mL色譜級(jí)甲醇洗脫，控制2mL/min（1滴/秒）流速，收集全部洗脫液，混勻，注入HPLC檢測(cè)。
2  中檢維康優(yōu)化方法：
1.1樣品提取及稀釋：
準(zhǔn)確稱取試樣5.0g于50mL離心管中，加入1g氯化鈉，準(zhǔn)確加入25.0mL乙腈-水（9+1），以均質(zhì)器高速攪拌提取2min（攪拌速度大于11000r/min）。普通濾紙過濾或4000RPM離心5min，準(zhǔn)確移取3.0mL濾液或上清液置于50mL離心管中，加入27mL0.5%的吐溫/PBS稀釋，混勻。用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，量取20mL濾液備用。
1.2樣品的凈化
    將免疫親和柱連接于20.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確量取20mL處理好的樣品濾液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約3mL/min（1滴/秒）流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體。以3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子，棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入2.0mL色譜級(jí)甲醇洗脫（注：可以用1ml甲醇洗脫，提高方法檢測(cè)靈敏度），控制2mL/min（1滴/秒）流速，收集全部洗脫液，混勻，注入HPLC檢測(cè)。
 
注意事項(xiàng)
1)      樣品添加回收試驗(yàn)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品添加到樣品中，靜置2小時(shí)后或過夜，再進(jìn)行樣品前處理，否則會(huì)出現(xiàn)回收率偏低的現(xiàn)象。
2)      不要隨便更改操作說明書中的操作步驟，如需更改要和本公司技術(shù)部聯(lián)系，確認(rèn)更改是否合理。
3)      操作步驟中，樣品過柱，淋洗，洗脫時(shí)，一定要控制好流速，不能太快，否則會(huì)使檢測(cè)結(jié)果偏低。
4)      如果將標(biāo)準(zhǔn)品直接過柱驗(yàn)證回收率時(shí)，一定要確保標(biāo)準(zhǔn)上柱液中甲醇濃度不要超過25%，乙腈濃度不要超過20%，否則會(huì)影響柱子的吸附能力。
5)      試驗(yàn)中使用的玻璃儀器等，一定要清洗干凈，尤其是用次氯酸等處理過的儀器，否則會(huì)使檢測(cè)結(jié)果偏低。
   需要準(zhǔn)備的設(shè)備及試劑（中檢維康提供）

C/N編號(hào)	物品
PHRED	美國奧拉AURA光化學(xué)衍生器
UVD	科樂福CLOVER光化學(xué)衍生器
21022	科樂福CLOVER六位泵流操作架（配有1臺(tái)空氣泵，6個(gè)10mL針筒）
20202	高速勻質(zhì)器，轉(zhuǎn)速可達(dá)18,000 r/min ~22,000 r/min
31955-C	美國CLOVER微纖維濾紙（1.5um，100張/盒）
31240-C	折疊式槽紋濾紙（100張/盒），或中速定性濾紙
36010-C	一次性塑料燒杯(25/包)
34000-C	一次性測(cè)試管(250支/包)
36020-C	塑料漏斗(10 個(gè)/包)
46304-U	黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品1.0mL （B1和G1為1.0ug/mL,B2和G2為0.3ug/mL）
35016	色譜純級(jí)的甲醇（4升/瓶）
C546150-U	科樂福Cloversil  C18 反相色譜柱4.6*150mm（5um）
C546250-U	科樂福Cloversil  C18 反相色譜柱4.6*250mm（5um）
	玉米、飼料等基質(zhì)含有不同水平黃曲霉毒素的質(zhì)控樣品
C3007-250	10X Clover淋洗緩沖液
C3008-250	10X 0.5%的吐溫-20/pH7.0 PBS溶液