神經元結構及活性的創(chuàng)新分析方案：長時程+實時定量

 
人的大腦中有數百億的神經元，它是神經系統最基本的結構和功能單位。神經元分為胞體和突起（Neurite）兩部分，突起進一步分為軸突和樹突。神經元通過突起與其他神經元的樹突和軸突形成突觸來進行信息傳遞（上圖），與藥物研發(fā)、退行性病變、神經損傷再生和神經元分化等息息相關。
   
傳統檢測神經元的方法存在一些局限：

• 在神經元成熟的整個過程中分析單個終點（比如免疫組化），不但無法進行重復的動力學評估，而且需要進行固定、染色、漂洗、采集和分析圖片，步驟繁瑣；
• 也無法與生理相關環(huán)境結合獲取全面信息；
• 無法確認細胞形態(tài)、空間分辨率或評估功能的連接性；
• 只能測定有限數量的細胞，無法模擬真實的網絡環(huán)境。

 
 
Incucyte®提供創(chuàng)新型分析方案，實現長時程、實時、連續(xù)的定量監(jiān)測

Incucyte® 實時活細胞分析系統可以置于細胞培養(yǎng)箱內，長時程自動采集相差和熒光圖片，配合專門開發(fā)的NeuroTrack軟件模塊可以自動地完成圖片的定量分析，獲得突起長度（Neurite length）和分支（Branch points）等反應神經元結構變化的指標。Incucyte® 的載物臺里可以同時檢測6個96孔板，滿足高通量實驗需求。不同的用戶可以通過局域網在辦公室內對各自的實驗進行檢測設置、圖片預覽或定量分析，不需要頻繁出入細胞間（下圖）。
  究竟有何過人之處？下面就來深入了解一下具體的應用吧！
 
1  利用實時的相差成像來追蹤不同類型神經元突起的生長

將iPSC來源的神經元iCell、原代大鼠皮層神經元和Neuro-2A神經元接種到96孔板里，采集間隔為2-6 h，共檢測150 h。下圖展示了大鼠皮層神經元在接種后第0、3和5天的相差圖片，可以看到神經元形態(tài)很清晰，隨培養(yǎng)時間的延長神經元胞體的數量沒有明顯改變，但突起的長度和分支顯著增加。NeuroTrack可以很準確地識別和定量神經元的突起和胞體，識別的神經突起以黃線圈描，神經元胞體以藍色填充表示。右圖分別展示了三種神經元隨培養(yǎng)時間延長其神經突起和分支的時間動力學曲線，都呈上升趨勢。
  原代、iPSC來源和神經元細胞系的相差圖片和定量分析結果

2  記錄將人多能干細胞誘導分化為感覺神經元的過程

Nickolls等人發(fā)現在人多能干細胞內轉錄過表達NGN2-BRN3A后可以有效誘導其分化為感覺神經元⑴。向培養(yǎng)的人多能干細胞培養(yǎng)體系中加入doxycycline刺激NGN2-BRN3A轉錄表達，使用Incucyte® 記錄了加藥后第2-5天細胞形態(tài)的變化過程。從視頻里我們可以看到神經突起在不斷的伸長，慢慢形成神經網絡，多能干細胞樣的形態(tài)逐漸消失變成較大的、圓形神經元胞體。
   
3  使用細胞膜完整性指示劑CytoTox表征谷氨酸誘導的神經元毒性

將大鼠前腦原代神經元接種在96孔板中，向培養(yǎng)體系中加入333 μM谷氨酸Glutamate，同時加入Cytotox Red和不同濃度梯度的NMDA受體的拮抗劑MK801，間隔6h采集相差和紅光通道圖片，共檢測78h。利用標準軟件識別和定量每個孔里每個時間點采集的圖片里帶紅色熒光即已死亡的神經元數量，以采集的時間點為橫坐標得到每個孔里死亡的神經元數量隨時間的動力學曲線圖。從96孔透視圖里可以很直觀地看到各組曲線的差異，且相同加藥組孔間的一致性很高（n=5或8），說明檢測的重復性很好。

從下左、中圖可以看到只加入333 μM谷氨酸組與其他組相比死亡的細胞數更多，說明谷氨酸的興奮性毒性使原代神經元死亡。而加入谷氨酸NMDA受體的拮抗劑MK801后，可以劑量依賴性降低谷氨酸的興奮性毒性作用，說明谷氨酸介導的興奮性毒性作用與其NMDA受體有關。不同濃度梯度的MK801本身不會對神經元產生毒性作用（下中圖）。以MK801濃度的對數值為橫坐標，以MK801作用24h后死亡的神經元數量為縱坐標生成劑量效應曲線，利用Incucyte® 的軟件對其進行擬合得到MK801作用24h時的IC50=14 nM（右下圖）。
 
4  使用神經元標記試劑NeuroLight和Annexin V表征神經元-膠質共培養(yǎng)體系中神經元的活性和結構

膠質細胞對神經元有支持和保護功能，下面分享一個神經元和膠質細胞共培養(yǎng)的應用案例。實驗時先接種大鼠前腦神經元，加入紅色NeuroLight試劑孵育4h以特異性地標記神經元，然后向體系中加入膠質細胞進行共培養(yǎng)，采集間隔為6h，共檢測13天。從圖E的上圖可以看到體外培養(yǎng)9天后原代神經元的胞體和突起均帶有紅色熒光信號，NeuroTrack準確地圈描出神經元的突起（藍線）和胞體（綠色填充），定量的結果顯示神經元接種后神經突起的長度隨著培養(yǎng)時間的延長而增加（圖A）。

在第9天向該共培養(yǎng)體系中加入凋亡指示試劑Annexin V和不同濃度梯度的谷氨酸后，神經元突起的長度開始減少且呈濃度依賴性（下圖A和B），24h時突起長度下降最明顯，且在接下來的近90h的檢測周期內一直沒有回復。研究同時定量了凋亡指示劑Annexin V即綠色熒光信號的匯合度，也呈劑量依賴性，且對谷氨酸更敏感，4.11μM的谷氨酸也有明顯的促凋亡作用。加藥后8h谷氨酸的促凋亡作用最強（見圖E的綠色和黃色信號），之后信號開始下降，說明神經元開始恢復，70h后加藥組凋亡信號與溶劑組一致（見圖C）。比較兩個指標結果，我們可以發(fā)現谷氨酸對神經元的促凋亡作用是可逆的，但對神經元結構即突起長度的影響較持久。神經元雖然是大腦內最小的結構單元，但其對外界刺激的應答是多樣性的。

D圖將24h時神經元突起長度和8h時Annexin V對應的劑量效應曲線合并到一起，橫軸是谷氨酸濃度的對數值，前者隨濃度下降，后者隨濃度增加。軟件根據劑量效應曲線擬合出谷氨酸在對應時間點的IC50=16μM和EC50=21μM。
  原代神經元-膠質共培養(yǎng)體系雙重檢測可以同時表征神經元活性和結構
 
 
Summary
 
本文分享了Incucyte®、NeuroTrack軟件模塊和無干擾試劑組合方案在神經元單重和共培養(yǎng)體系中的應用，通過實時采集和分析圖片可以同時獲得反應神經元活性和結構的相關指標，可以導出圖片、視頻、定量曲線、IC50和EC50值。長時程動態(tài)檢測可以獲得更加準確和豐富的信息比如藥物什么時候起效、什么時候效應最強以及這種效應是可逆還是持久的等信息，這些是傳統終點檢測方法很難做到的。
 
總而言之，Incucyte® 神經元分析是一套綜合的解決方案，由儀器、軟件和試劑組成，可對復雜的神經元活動進行前所未有的評估，深入了解神經元細胞模型的功能。

除了研究神經元的活性和結構，對于神經元之間信息傳遞的最重要方式——動作電位，Incucyte® 也有完整的解決方案，我們會繼續(xù)為大家分享對應的內容的。
 
 
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下載白皮書《實時活細胞分析技術在神經科學研究中的應用》，了解創(chuàng)新型神經科研細胞分析方案。
  
-參考文獻-

⑴ Nickolls AR, Lee MM, Espinoza DF, Szczot M, Lam RM, Wang Q, Beers J, Zou J, Nguyen MQ, Solinski HJ, AlJanahi AA, Johnson KR, Ward ME, Chesler AT, Bönnemann CG. Transcriptional Programming of Human Mechanosensory Neuron Subtypes from Pluripotent Stem Cells. Cell Rep. 2020 Jan 21;30(3):932-946.e7. doi: 10.1016/j.celrep.2019.12.062. PMID: 31968264; PMCID: PMC7059559.