ROM全基因組甲基化分析技術(shù)及其步驟方法

Bionano OGM是一種強(qiáng)大的光學(xué)圖譜技術(shù)，它使用超長(zhǎng)DNA分子從頭構(gòu)建整個(gè)基因組，并能夠有效地檢測(cè)基因組結(jié)構(gòu)變異。同時(shí)它還能用于基因組功能分析，如表觀遺傳學(xué)、DNA復(fù)制圖譜和動(dòng)力學(xué)分析等。其原理是利用熒光標(biāo)記基因組上特定序列，在納米孔道中電泳拉直DNA后拍照獲得熒光的分布，進(jìn)而分析特定序列在基因組上的分布和狀態(tài)。基于該原理，Bionano研發(fā)團(tuán)隊(duì)和科學(xué)界一起開發(fā)了多種熒光標(biāo)記方法，并不斷探索其在基因組研究中的應(yīng)用方向。例如基于特殊甲基轉(zhuǎn)移酶的DLS標(biāo)記方案和基于基因組缺刻酶的NLRS標(biāo)記方案。除此之外還有很多特殊的標(biāo)記方法，其中不乏非常有前景的方向。2019年Bionano研發(fā)團(tuán)隊(duì)與科研工作者在Genome Research雜志上公布了一種基于熒光甲基化圖譜的檢測(cè)方案-ROM, 并測(cè)試了該方法在面肩肱型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥 (FSHD)中的應(yīng)用【1】。

DNA甲基化與研究方法

DNA甲基化在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵作用�；�因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)可以預(yù)測(cè)基因活性，且研究發(fā)現(xiàn)發(fā)育過程中和疾病中的DNA甲基化與基因表達(dá)和蛋白質(zhì)豐度相關(guān)。目前DNA甲基化的主要研究方法是NGS甲基化測(cè)序，即利用不同手段將甲基化和非甲基化的堿基區(qū)分并分別測(cè)序。但是甲基化測(cè)序需要較高的深度，并且經(jīng)常需要同時(shí)對(duì)未處理的原始DNA進(jìn)行測(cè)序比較，因此成本相對(duì)較高；同時(shí)在基因組中復(fù)雜度較低的重復(fù)區(qū)域中，由于NGS測(cè)得的序列較短，存在比對(duì)困難，對(duì)于這些區(qū)域的甲基化狀態(tài)很難解析。三代測(cè)序（SMRT和ONT測(cè)序）雖然能夠?qū)�DNA甲基化狀態(tài)直接檢測(cè)，但也存在通量低，成本高的不足。在全基因組光學(xué)圖譜（OGM）分析中，增加熒光基團(tuán)標(biāo)記甲基化或者非甲基化DNA片段，就可以對(duì)全基因組范圍內(nèi)的甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究。由于OGM檢測(cè)單分子超長(zhǎng)DNA片段，在分析低復(fù)雜的重復(fù)區(qū)域中具有先天優(yōu)勢(shì)。

ROM標(biāo)記方案
如圖1所示，ROM標(biāo)記主要有兩個(gè)步驟（具體條件可參考原文【1】）：

缺刻酶介導(dǎo)的NLR全基因組標(biāo)記: 抽提的超長(zhǎng)片段基因組DNA在缺刻酶作用下在對(duì)應(yīng)的基因組片段上產(chǎn)生缺口。隨后利用Taq DNA合成酶進(jìn)行缺口平移，同時(shí)將帶有熒光標(biāo)記基團(tuán)的dNTP摻入新合成的鏈中。最后在Taq DNA連接酶的作用下將缺口連接，形成完整的雙鏈。這樣熒光標(biāo)記就在相應(yīng)的基因組序列motif附近出現(xiàn)。

M.TaqI甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的熒光標(biāo)記: M.TaqI甲基轉(zhuǎn)移酶可以在基因組中特定motif(TCGA)的腺嘌呤(A)上轉(zhuǎn)入一個(gè)甲基，但是這個(gè)反應(yīng)會(huì)受到鄰近的CpG中C堿基的甲基化或者羥甲基化影響。也就是說一旦TCGA中的C堿基是被甲基化或者羥甲基化的，該反應(yīng)就會(huì)無法完成。ROM分析將甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的底物替換成帶有熒光標(biāo)記的類似物，就可以區(qū)分出TCGA中的甲基化狀態(tài)。

雙色熒光標(biāo)記: 抽提的超長(zhǎng)片段DNA首先使用NLR缺刻酶全基因組標(biāo)記并使用紅色熒光標(biāo)記基團(tuán)；隨后500ng標(biāo)記好的DNA使用M.TaqI甲基轉(zhuǎn)移酶和綠色熒光底物進(jìn)行第二輪標(biāo)記；標(biāo)記完成后使用藍(lán)色染料對(duì)DNA骨架進(jìn)行染色。隨后得到的標(biāo)記染色后的DNA在Bionano OGM平臺(tái)上進(jìn)行電泳和數(shù)據(jù)收集。

圖1 M.TaqI甲基轉(zhuǎn)移酶區(qū)分甲基化非甲基化標(biāo)記原理

ROM可行性驗(yàn)證
為了驗(yàn)證該方法的可行性，研究團(tuán)隊(duì)使用ROM 針對(duì)FSHD相關(guān)區(qū)域（D4Z4 repeats）同時(shí)進(jìn)行了拷貝數(shù)和甲基化的分析。

FSHD-associated D4Z4 repeats BAC文庫測(cè)試
將正常人的D4Z4區(qū)段轉(zhuǎn)入BAC文庫后，研究團(tuán)隊(duì)使用多種方法對(duì)其進(jìn)行了分析。

1. 首先使用超高深度（大于15000X）NGS測(cè)序，希望利用重復(fù)區(qū)域和非重復(fù)區(qū)域的測(cè)序深度比例來推測(cè)拷貝數(shù)。然而作者發(fā)現(xiàn)兩種區(qū)域內(nèi)部的深度變異也非常大（非重復(fù)區(qū)域平均差在25%左右，重復(fù)區(qū)域更是高達(dá)63%），推測(cè)會(huì)造成估算的不準(zhǔn)確。最終利用平均深度的比例，NGS預(yù)測(cè)D4Z4重復(fù)次數(shù)為8，但是不確定性非常大。

2. 隨后使用NLR方法將BAC文庫分子標(biāo)記上紅色熒光基團(tuán)后，在修飾后的玻片上拉直，熒光顯微鏡下直接觀察。通過直接計(jì)數(shù)標(biāo)記個(gè)數(shù)（D4Z4每一個(gè)repeat中都有一個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)），直觀得到了準(zhǔn)確的D4Z4重復(fù)數(shù)為22（如圖2）。

圖2 左: D4Z4 repeats BAC文庫示意圖右: 標(biāo)記后的單個(gè)BAC分子

3. 標(biāo)記后的DNA在Iyrs平臺(tái)上進(jìn)行電泳拍照，利用單分子組裝成D4Z4區(qū)域的完整圖譜。通過和參考基因組的比較得到D4Z4 repeats的個(gè)數(shù)為22 ± 1（圖3）。

圖3 OGM組裝后的分子和圖譜，灰色區(qū)域?yàn)榉荄4Z4重復(fù)區(qū)段

4. 最后針對(duì)BAC文庫進(jìn)行了ROM分析。作者使用紅色熒光來確定基因組標(biāo)記，綠色熒光來標(biāo)記甲基化狀態(tài)。使用非甲基化修飾的BAC文庫和部分甲基化的BAC文庫顯示了非常明顯的熒光信號(hào)區(qū)別（圖4），從而證明ROM是一種可行的甲基化分析方案。

圖4 甲基化和部分甲基化BAC文庫的ROM分析結(jié)果

FSHD 家系樣本測(cè)試在一個(gè)FSHD家系中，使用ROM分析了一個(gè)病人樣本和一個(gè)健康親屬樣本�；�因組組裝結(jié)果顯示在FSHD病人中，致病D4Z4重復(fù)數(shù)（4qA）為4, 而健康親屬的D4Z4重復(fù)數(shù)（4qA）為26；兩個(gè)樣本另外一個(gè)等位基因均為非致病性的4qB，且重復(fù)數(shù)為48（圖5）。

圖5  D4Z4片段重復(fù)數(shù)，左側(cè)為陽性樣本，右側(cè)為陰性樣本

ROM分析也發(fā)現(xiàn)FSHD陽性樣本中，無論是D4Z4重復(fù)的單個(gè)片段甲基化程度（圖6）還是平均甲基化程度（圖7）都明顯低于陰性樣本，從而證明D4Z4重復(fù)片段的去甲基化與FSHD疾病的相關(guān)。

圖6  ROM分析信號(hào)，左側(cè)為陽性樣本，右側(cè)為陰性樣本

圖7  ROM分析顯示的平均去甲基化程度，左側(cè)為陽性樣本，右側(cè)為陰性樣本

總結(jié)

OGM技術(shù)能夠結(jié)合多種標(biāo)記手段，ROM為我們展示了結(jié)合基因組骨架標(biāo)記和甲基化標(biāo)記的分析方案。相信可以期待更多的特異性或非特異性標(biāo)記技術(shù)與OGM骨架標(biāo)記結(jié)合，完成針對(duì)不同應(yīng)用的分析。