構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株與其單克隆化的方法與應(yīng)用要點(diǎn)

穩(wěn)轉(zhuǎn)株是指通過(guò)基因工程手段獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或抑制特定基因的細(xì)胞株。一般將目的基因序列或抑制目的基因的shRNA序列裝載至重組載體中，再通過(guò)慢病毒系統(tǒng)或轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將目的序列整合至宿主細(xì)胞的染色體中，實(shí)現(xiàn)目的基因持續(xù)、穩(wěn)定的調(diào)控。

通過(guò)慢病毒系統(tǒng)或轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)染并經(jīng)過(guò)藥物篩選獲得的陽(yáng)性細(xì)胞是一個(gè)混合細(xì)胞池，即多克隆細(xì)胞系。單克隆細(xì)胞系則是從多克隆細(xì)胞系中分選得到的，由單一細(xì)胞擴(kuò)增得到的細(xì)胞株。穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞系是科研工作者常用的基因調(diào)控細(xì)胞模型，常規(guī)的科研實(shí)驗(yàn)，多克隆細(xì)胞系是可以滿足需求的，但某些應(yīng)用場(chǎng)景需要穩(wěn)轉(zhuǎn)株單克隆化。今天與大家一起回顧穩(wěn)轉(zhuǎn)株與其單克隆化的應(yīng)用要點(diǎn)。

一、什么時(shí)候需要構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株呢？

❖長(zhǎng)期在目的細(xì)胞中研究基因的功能

❖部分蛋白半衰期極長(zhǎng)，瞬時(shí)RNA只能干擾表達(dá)，無(wú)法去除已經(jīng)表達(dá)的目的蛋白，想要實(shí)現(xiàn)更好的基因干擾效果

❖需要用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的，主要是一些致死基因或者是需要時(shí)空表達(dá)的

❖需要用細(xì)胞做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的，比如裸鼠成瘤等

❖需要進(jìn)行藥物篩選、構(gòu)建重組蛋白、生產(chǎn)制備抗體和報(bào)告細(xì)胞系等也需要構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株

二、單克隆化的優(yōu)點(diǎn)與必要性
藥物篩選獲得的多克隆細(xì)胞系由單克隆細(xì)胞株組成的。由于慢病毒整合位點(diǎn)與拷貝數(shù)的不確定性導(dǎo)致各個(gè)單克隆基因組存在異質(zhì)性，使每個(gè)單克隆的目的基因表達(dá)水平和細(xì)胞表型也不相同。不經(jīng)過(guò)單克隆化而繼續(xù)傳代培養(yǎng)，由于各單克隆的生長(zhǎng)速度不一致（目的基因表達(dá)較低的克隆增殖速度較快），會(huì)存在生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)抑制的問(wèn)題，傳代多次以后高表達(dá)目的基因的單克隆會(huì)逐漸消失，出現(xiàn)多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株因多次傳代而表達(dá)量逐漸下降的現(xiàn)象。因此，單克隆化可以提高穩(wěn)轉(zhuǎn)株基因組的均一性和表型的穩(wěn)定性。

一般情況下，多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株是可以滿足我們的科研需求的，比如初步驗(yàn)證基因功能，其優(yōu)點(diǎn)是節(jié)省了單克隆化的時(shí)間與經(jīng)濟(jì)成本。但得出的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性與重復(fù)性往往欠佳，如果想減少實(shí)驗(yàn)的波動(dòng)，提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，展現(xiàn)更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，則需要單克隆化。此外，用于工業(yè)生產(chǎn)的穩(wěn)轉(zhuǎn)株一般都需要進(jìn)行單克隆化。工業(yè)生產(chǎn)中需要保證生產(chǎn)工藝和質(zhì)量穩(wěn)定可控，因此需要通過(guò)單克隆化將細(xì)胞庫(kù)的異質(zhì)性降至最低。此外，還有一些特殊的情況需要單克隆化。比如由于不同細(xì)胞系與目的基因自身生物學(xué)的特性，會(huì)存在轉(zhuǎn)染效率低、表達(dá)效率過(guò)低或過(guò)高，構(gòu)建得到的多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株中只有個(gè)別克隆的符合表達(dá)需求，此時(shí)則需要進(jìn)行單克隆化分選合適的細(xì)胞系。

三、單克隆化的方法
單細(xì)胞分離方法中，常見(jiàn)的有限稀釋法（limiting dilution cloning, LDC）和流式細(xì)胞術(shù)分選法等。此外，克隆篩選單細(xì)胞打印系統(tǒng)、ClonePix高通量細(xì)胞克隆篩選系統(tǒng)和細(xì)胞成像技術(shù)等新技術(shù)也逐漸用于細(xì)胞單克隆化或確認(rèn)單克隆性，有效提高篩選的效率和精度。

★有限稀釋法：
該方法是將混合細(xì)胞池以一定梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)�再�?.5cell/孔或以下的要求進(jìn)行鋪板。該方法是現(xiàn)今最常用的，具有操作簡(jiǎn)單、對(duì)設(shè)備要求較低等優(yōu)點(diǎn)。但依賴(lài)人工操作，耗時(shí)久、效率低、花費(fèi)大量的96或384孔板等缺點(diǎn)也需要關(guān)注。并且篩選得到的克隆只是基于稀釋比例得到的理論單克隆，難以確定所選細(xì)胞是單克隆。該方法通過(guò)結(jié)合成像系統(tǒng)技術(shù)，記錄每個(gè)單孔中的克隆初始狀態(tài)和生長(zhǎng)情況，則可以提高有限稀釋法的精度。

★流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)：
依據(jù)細(xì)胞的大小、細(xì)胞內(nèi)含物復(fù)雜程度、細(xì)胞內(nèi)所含的熒光染料、細(xì)胞表面膜蛋白等參數(shù)，可以通過(guò)流式細(xì)胞儀從多克隆細(xì)胞池中分選出單克隆。一般可以分選下列兩種情況的細(xì)胞，一是在慢病毒載體中插入了熒光標(biāo)記，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)表達(dá)熒光蛋白，并通過(guò)其進(jìn)行分選。第二種是過(guò)表達(dá)某種蛋白于細(xì)胞膜表面，此時(shí)用帶有熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行孵育，再通過(guò)流式進(jìn)行分選。使用流式細(xì)胞儀分選單細(xì)胞，單克隆形成率高，并且可以與單克隆成像系統(tǒng)連用，確定單克隆。

四、總結(jié)
穩(wěn)轉(zhuǎn)株是研究基因功能和生物醫(yī)藥生產(chǎn)應(yīng)用的重要細(xì)胞工具，且穩(wěn)轉(zhuǎn)株單克隆化可有效提高細(xì)胞系的均一性。我們可以根據(jù)實(shí)際需求，考慮是否單克隆化。
 

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