HEK293細胞瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)與常用結(jié)果分析

HEK293細胞是新藥開發(fā)研究的主要細胞，本文初步介紹了細胞的瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)并常用的結(jié)果分析方法：

HEK293T貼壁細胞瞬時轉(zhuǎn)染：
1. 使用 12.5 mL 培養(yǎng)基 將 HEK293T 細胞接種到 10 cm 板中，以在日培養(yǎng)后達到 70-80% 的融合度。
2. 為了提高轉(zhuǎn)染和生產(chǎn)過程中的細胞粘附，用無菌聚 L-賴氨酸0.01% (w/v)，75–150 kDa，細胞培養(yǎng)級）制備板 15 分鐘，然后用無菌磷酸鹽緩沖鹽水（PBS；137 mM NaCl、2.6 mM KCl、8 mM Na 2 HPO 4、1.5 mM KH 2 PO 4）。 
3. 用 10 μg 聚乙烯酰亞胺 進行轉(zhuǎn)染。將 10 μg 高質(zhì)量質(zhì)粒 DNA和 80 μg/mL PEI 分別稀釋在 600 μL DMEM 中。
4. 將 DNA 和 PEI 溶液混合并在室溫 (RT) 下孵育 15-30 分鐘。DNA/PEI 復(fù)合物分布在細胞上并孵育 24 小時。
5. 第二天，培養(yǎng)基完全被補充有 4% (v/v) IgG 剝離 FCS (PAA) 和青霉素/鏈霉素的 DMEM 替代，以較大限度地減少蛋白質(zhì) A/G 親和層析對牛 IgG 的共純化。
6. 通常每天收獲和更換培養(yǎng)基長達兩周。每天收獲和更換生產(chǎn)培養(yǎng)基長達 1-2 周。



在懸浮 HEK293-6E 細胞中瞬時轉(zhuǎn)染和生產(chǎn)
1. 在懸浮 HEK293細胞中進行瞬時生產(chǎn)。簡而言之，轉(zhuǎn)染前兩天 5×10 5細胞/mL HEK293-6E 在 25 至 150 mL 無血清培養(yǎng)基（不含 G418）中接種到 125 至 1000 mL 帶通氣膜蓋的聚碳酸酯錐形瓶中，并在 37°C 和 110 rpm 下孵育在軌道振動器中。
2. 對于小規(guī)模生產(chǎn)，將 12 孔板中的 1 mL/孔在線性振蕩器中以 150 rpm 的速度孵育。如果沒有另外說明，應(yīng)當在 1/10 體積的新鮮無血清培養(yǎng)基中制備總計 1 μg 高質(zhì)量質(zhì)粒 DNA 和 2.5 μg PEI/mL 培養(yǎng)體積。
3. 量化編碼增強型綠色熒光蛋白 (EGFP) 或黃色熒光蛋白 (YFP) 變體 venus 的報告質(zhì)粒 pEF-FS-EGFP 或 pCS2-venus 總 DNA 的 1/20 的轉(zhuǎn)染效率 ，分別添加。
4. 加入 DNA/PEI 復(fù)合物后，將細胞進一步培養(yǎng) 48 小時。然后按照其他方法與另外體積的新鮮培養(yǎng)基一起添加終了濃度為 0.5% (w/v) 的胰蛋白胨 N1。

蛋白 A 純化
所有scFv-hIgG1Fc 抗體和 scFv-hIgG1Fc-RNase 構(gòu)建體可使用 1 mL Bio-Scale Mini UNOsphere SUPrA Cartridges 和Biorad的半自動Profinia 2.0 系統(tǒng)，根據(jù)標準制造商的方案通過蛋白 A 親和純化進行純化。

流式細胞儀分析
通常在轉(zhuǎn)染后 48 小時使用流式細胞儀來測量轉(zhuǎn)染效率。通過熒光 (FL) 1 中 GFP（pTTo/GFPq、NRC、BRI；總質(zhì)粒 DNA 的 5%）或 YFP 的共表達來檢測轉(zhuǎn)染的細胞。用 2 μg/mL 碘化丙啶對死細胞進行染色。

十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 ( (SDS-PAGE)
SDS-PAGE 可以使用天能相關(guān)的試劑及電泳槽進行電泳分離。蛋白質(zhì)標準品和樣品在還原條件下用 Laemmli 樣品緩沖液在 95°C 下制備 5 分鐘，或在非還原條件下（不含還原劑的 Laemmli 樣品緩沖液）在 65°C 下制備 10 分鐘。使用SDS-PAGE進行凝膠電泳操作。然后進行考馬斯染色。再通過 IgG/Fc 捕獲 ELISA 和凝膠光密度法定量 scFv-Fc 抗體。

通過IgG/Fc捕獲ELISA對生產(chǎn)上清液中的抗體進行定量的簡要步驟如下：
1. 共 100 μL/孔山羊抗人免疫球蛋白（多價）捕獲抗體（200 ng/mL）在 PBS 中稀釋并包被在 96 孔微量滴定板中在 37°C 下 1 小時。
2. 在 37°C 下用 20% (v/v) FCS 封閉 1 小時后，使用洗板器用 PBST（含 0.05% [v/v] tween-20 的 PBS）洗滌孔 3 次。
3. 在含有 1% (v/v) FCS 的 PBS 中制備總共 100 μL/孔的幾種樣品稀釋液和半稀釋系列的人 IgG 蛋白標準品，并在 37 ℃孵育 1 小時。
4. 洗滌后，將總共 100 μL/孔的 20 ng/mL 山羊抗人 IgG（Fc 特異性）抗體辣根過氧化物酶 (HRP) 偶聯(lián)物在室溫下孵育 1 小時。 37℃。并通過添加 100 μL/孔的 0.5 MH 2 SO 4停止。
5. 使用酶標儀在 450 nm 處針對 620 nm 的參考波長 (A 450 -A 620 )測量吸光度。此外，在無血清培養(yǎng)條件下在 HEK293-6E 細胞中產(chǎn)生的重組蛋白在考馬斯染色后通過 SDS-PAGE 進行定量。 在還原條件下制備樣品，并使用分析軟件與純化的標準蛋白質(zhì)進行比較。

代謝細胞培養(yǎng)參數(shù)的定量測量   
用基于膜的酶分析儀對葡萄糖和 L-乳酸進行定量。同時酶標儀也可用于測量 L-谷氨酰胺與 L-谷氨酸的組合。

HEK293-6E 中的瞬時表達與優(yōu)化的表達載體和分批補料工藝相結(jié)合，可提供高達 600 mg/L 重組 IgG 樣 scFv-Fc 抗體的穩(wěn)健和多功能生產(chǎn)。  該表達系統(tǒng)已被證明可以在搖瓶中從毫升擴展到升體積，這可以解決高通量體外抗體生成管道的生產(chǎn)瓶頸。此外，與小的重組抗體片 段相比，更復(fù)雜的 IgG 樣 scFv-Fc 抗體的高效分泌生產(chǎn)有助于下游加工并增加與標準免疫測定和其他應(yīng)用的兼容性。