CELL：轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用網(wǎng)絡(luò)對(duì)人類心臟的功能維持具有重要意義

研究亮點(diǎn)：

1 系統(tǒng)性方法揭示了GATA4在人類心臟發(fā)育和功能中的作用
2 雜合子GATA4錯(cuò)義突變損害心臟基因程序
3 GATA4 G296S突變破壞了心臟增強(qiáng)子TBX5的基因組占用
4 PI3K信號(hào)通路是GATA4基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵樞紐

研究背景

轉(zhuǎn)錄因子(TFs)之間的組合相互作用導(dǎo)致組織特異性基因表達(dá)，從而決定了細(xì)胞的特性并維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平。TFs通過(guò)招募其他TFs、輔激活因子或輔抑制因子來(lái)激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄。超級(jí)增強(qiáng)子(SEs)，被中介復(fù)合物和TFs密集占據(jù)的假定增強(qiáng)子簇，被認(rèn)為是發(fā)育和疾病中細(xì)胞同一性的調(diào)節(jié)因子。SEs的失調(diào)可能導(dǎo)致人類胚胎發(fā)生發(fā)育障礙和產(chǎn)后疾病。發(fā)育畸形占人類出生率大于5%。其中，先天性心臟缺損所占比例最高（0.8%），而且通常是由于發(fā)育性調(diào)節(jié)型心臟TFs單倍型不足而導(dǎo)致的。在TFs中雜合突變GATA4和TBX5會(huì)導(dǎo)致家族性先天性心臟發(fā)育不全，二者表型重疊；當(dāng)過(guò)表達(dá)這兩個(gè)基因時(shí)，兩者免疫共定位。在零星的先天性心臟發(fā)育不全中，這兩個(gè)基因存在突變，且與心肌病相關(guān)。我們之前的研究表明，GATA4在G296S位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致GATA4和TBX5在體外的互作能力受損。攜帶復(fù)合雜合子Gata4和Tbx5突變的小鼠會(huì)發(fā)生房室間隔缺損，為GATA4與TBX5二者之間的互作提供了遺傳學(xué)證據(jù)。

盡管Gata4和Tbx5對(duì)小鼠心臟發(fā)生至關(guān)重要，但它們?cè)谌祟愋募〖?xì)胞（CMs）中共同調(diào)節(jié)的基因靶點(diǎn)或信號(hào)通路以及它們?nèi)绾握{(diào)節(jié)人類心臟間隔的形成尚不清楚。與GATA4相互作用的TBX5或Nkx2.5完全缺失，表明這些TFs在小鼠心臟分化中相互依賴調(diào)節(jié)彼此的基因組占用。

研究結(jié)果

轉(zhuǎn)錄因子中高度保守殘基的突變可能會(huì)影響蛋白與蛋白或蛋白間的相互作用，導(dǎo)致基因網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)和人類疾病。本研究使用患者源性誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)細(xì)胞來(lái)剖析GATA4在人類心臟發(fā)育和功能中的調(diào)節(jié)機(jī)制。研究人員利用了來(lái)自于患者G296S突變的、通過(guò)CRISPR-Cas9修正的(iWT) 以及正常人的野生型（WT）成纖維細(xì)胞以非整合游離載體方法重編程獲得三種iPS，在圖案化水凝膠的作用下將iPS培養(yǎng)分化為心肌細(xì)胞CMs。在分化CMs過(guò)程中，對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析，對(duì)心肌細(xì)胞分化過(guò)程中的標(biāo)志性基因表達(dá)情況，鈣通量及顯微鏡下形態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)和分析。

研究發(fā)現(xiàn)，雜合的GATA4 G296S突變損害了心臟基因程序和sonic hedgehog (SHH)信號(hào)通路的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)了可變命運(yùn)基因的表達(dá)，特別是內(nèi)皮細(xì)胞譜系和與心臟分隔相關(guān)的基因。在與心臟發(fā)育和肌肉收縮相關(guān)的基因SE元件處，GATA4依賴的TBX5的募集被中斷，而在參與內(nèi)皮分化的基因座染色質(zhì)關(guān)閉失敗。這項(xiàng)工作揭示了一個(gè)關(guān)鍵心臟TF的單一錯(cuò)義突變是如何通過(guò)劑量依賴性調(diào)節(jié)TF復(fù)合物向增強(qiáng)因子的招募而導(dǎo)致疾病的，并揭示了治療干預(yù)的潛在節(jié)點(diǎn)。

圖1 G296S CMs心臟功能受損。（A）流式分析來(lái)源于WT和G296S分化而來(lái)的、乳酸純化后的cTnT+CMs 。（B）CMs的單細(xì)胞陣列的微圖(上)和α-Actinin或F-actin的免疫染色(下)。（C）微觀模式的收縮測(cè)量。WT和G296S單厘米對(duì)1 Hz起搏響應(yīng)的百分比（左圖）。牽引力顯微鏡測(cè)量力產(chǎn)生作為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的CMs對(duì)1Hz起搏響應(yīng)的函數(shù)(右圖)。（D） WT和G296S CMs的動(dòng)作電位測(cè)量。（E）微團(tuán)簇上鈣通量的測(cè)量。（F）特定微組織的鈣通量測(cè)量。（G）α-Actinin染色觀察單個(gè)肉瘤類CMs所占的百分比。（H）線粒體單厘米微模式染色強(qiáng)度(上圖)。定量測(cè)量細(xì)胞核分裂追蹤器相對(duì)于細(xì)胞面積的紅色強(qiáng)度(下圖)。（I）糖酵解功能測(cè)量。

圖2 GATA4 - TBX5 GRN顯示樞紐集中于PI3K信號(hào)。（A）GATA4控制的GRN（B）按基因符號(hào)命名的前20個(gè)樞紐的子網(wǎng)絡(luò)圖（C）在PI3K信號(hào)被抑制(圓形)或激活(三角形)后iWT(黑色)和G296S(紅色)CMs產(chǎn)生的相對(duì)變化（D）PI3K信號(hào)被抑制(圓形)或激活(三角形)后，iWT(黑色)和G296S(紅色)CMs的搏動(dòng)率測(cè)量（E）假設(shè)模型。上圖，WT基因的心臟基因位點(diǎn)開放且允許G4T5與med1結(jié)合的SE元件結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄;G4T5和HDAC2抑制異常內(nèi)皮基因轉(zhuǎn)錄。下圖，GATA4 G296S的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳結(jié)果。心臟基因座降低了開放染色質(zhì)和TBX5與SE元素的結(jié)合，降低了轉(zhuǎn)錄;異常開放的染色質(zhì)缺失了GATA4-HDAC2，但TBX5富集，同時(shí)ETS因子的基序?qū)е聝?nèi)皮基因轉(zhuǎn)錄沉默失敗，其他參與間隔發(fā)育的位點(diǎn)未描述。

研究意義
本研究表明，適當(dāng)?shù)男呐K發(fā)育和功能需要MED1結(jié)合的h3k27ac標(biāo)記SE元素的GATA4-TBX5的共同參與，以維持開放的染色質(zhì)狀態(tài)并激活心源性基因轉(zhuǎn)錄。雜合性GATA4錯(cuò)義突變影響蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，TBX5無(wú)法募集到SE元件與未能保持開放的染色質(zhì)狀態(tài)以及心臟基因的轉(zhuǎn)錄降低有關(guān)。GATA4 G296S突變?cè)试STBX5和其他轉(zhuǎn)錄激活因子的錯(cuò)誤定位，導(dǎo)致無(wú)法招募到HDAC2，并在內(nèi)皮啟動(dòng)子上實(shí)現(xiàn)更封閉的染色質(zhì)特征。結(jié)果導(dǎo)致內(nèi)皮基因表達(dá)的異常激活和譜系改變。參與SHH信號(hào)接收和心臟分離的基因失調(diào)為GATA4 G296S患者的三維間隔缺損提供了分子基礎(chǔ)。這些研究揭示了TF復(fù)合物如何通過(guò)協(xié)同調(diào)控反式作用因子的全基因組定位來(lái)控制基因表達(dá)的激活和抑制，以及當(dāng)協(xié)同性被破壞時(shí)疾病是如何發(fā)生的。

這一研究結(jié)果解釋了一個(gè)啟動(dòng)人類心臟基因程序的組合TF結(jié)合密碼子，并揭示了通過(guò)錯(cuò)義突變破壞該密碼子如何導(dǎo)致表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄失調(diào)和人類疾病。ATAC-seq分析開放染色質(zhì)特征和GATA4和TBX5結(jié)合位點(diǎn)的全基因組分析提供了人類TF結(jié)合增強(qiáng)子的詳細(xì)目錄，并補(bǔ)充了稀缺心臟細(xì)胞類型的編碼數(shù)據(jù)，同時(shí)利用這些數(shù)據(jù)鑒定了一個(gè)假定的G4T5輔抑制子。綜上所述，本研究揭示了一個(gè)組合的TF代碼，這一代碼確保了一個(gè)強(qiáng)大的心臟基因程序，闡明了當(dāng)通過(guò)干擾該代碼的TF協(xié)同性時(shí)人類疾病是如何發(fā)生的，并提出了治療干預(yù)的潛在節(jié)點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)中特別涉及了一種細(xì)胞培養(yǎng)和測(cè)量手段

iPS-CMs細(xì)胞的體外培養(yǎng)
將細(xì)胞接種在聚丙烯酰胺水凝膠裝置上，該裝置具有基質(zhì)凝膠微結(jié)構(gòu)。由縮印手段在水凝膠表面制備長(zhǎng)寬比為7:1、面積為2000平方微米的矩形凹槽。這些特定的微結(jié)構(gòu)具備一定的剛度及形狀，有利于模擬體內(nèi)CMs的真實(shí)環(huán)境，可原位培養(yǎng)并分析單個(gè)CMs。之后，可用牽引力顯微鏡計(jì)算細(xì)胞附著在聚丙烯酰胺表面所產(chǎn)生的力。

單個(gè)CMs收縮力測(cè)量
在水凝膠中混入熒光微珠，使用Zeiss倒置顯微鏡測(cè)試收縮CMs的明場(chǎng)視頻以及因細(xì)胞收縮而移動(dòng)的綠色熒光微珠的視頻。明場(chǎng)視頻被用來(lái)計(jì)算每個(gè)收縮周期的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及平均位移。熒光微珠視頻則提交到牽引力顯微鏡算法來(lái)計(jì)算收縮力。

鈣通量分析，膜片鉗測(cè)試
Fluo-4染色后采用延時(shí)成像技術(shù)來(lái)測(cè)量鈣通量。選擇自發(fā)收縮的微團(tuán)簇的特定區(qū)域，用軟件量化動(dòng)作電位之間測(cè)量到的鈣瞬變表達(dá)相對(duì)于基線熒光的峰值振幅。采用全細(xì)胞膜片鉗在單細(xì)胞水平測(cè)量CMs的動(dòng)作電位
作為實(shí)驗(yàn)前置內(nèi)容，細(xì)胞培養(yǎng)與力學(xué)、鈣通量測(cè)試在后續(xù)基因表達(dá)分析工作中起到了關(guān)鍵性的作用。在該工作中使用的是英國(guó)Plexithermo的HCells高通量單細(xì)胞、器官功能測(cè)量及納米水凝膠3D培養(yǎng)系統(tǒng)。

該系統(tǒng)可使用多種定制水凝膠耗材模擬細(xì)胞微環(huán)境，亦可以自行設(shè)計(jì)蝕刻水凝膠以滿足不同的研究需求，尤其適用于心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)環(huán)境的構(gòu)建。搭配獨(dú)特的細(xì)胞追蹤技術(shù)，可短時(shí)間內(nèi)測(cè)量300個(gè)以上細(xì)胞的收縮及離子濃度變化情況。搭配多孔位細(xì)胞培養(yǎng)板，實(shí)現(xiàn)真正的高通量細(xì)胞測(cè)試，每個(gè)孔位即可作為一組對(duì)照實(shí)驗(yàn)，不同孔位同時(shí)培養(yǎng)，同時(shí)測(cè)量，極大節(jié)省時(shí)間及耗材。

適用范圍：

1、心肌細(xì)胞
采用超速成像納米水凝膠技術(shù)，可完美模擬器官硬度。批量測(cè)心肌細(xì)胞的力學(xué)指標(biāo)和離子濃度變化。包括細(xì)胞收縮速度和力度、收縮功率，收縮角度，速度差和力差等，

2、細(xì)胞遷移和精子運(yùn)動(dòng)軌跡
跟蹤檢測(cè)細(xì)胞軌跡，并可計(jì)算定量數(shù)據(jù)，如：運(yùn)動(dòng)軌跡，距離和速度。

3、動(dòng)態(tài)跟蹤細(xì)胞增殖的情況，如菌落形成。

4、人iPS細(xì)胞衍生神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞活力測(cè)定：神經(jīng)元運(yùn)動(dòng)的功率譜密度（PSD）可，用于準(zhǔn)確預(yù)測(cè)細(xì)胞死亡。PSD表示一個(gè)單元在頻域中的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，能夠更精確地預(yù)測(cè)細(xì)胞死亡。

5、核跟蹤特征可用于分析癌細(xì)胞遷移

6、測(cè)量對(duì)象：癌細(xì)胞、斑馬魚、精子、菌落、貼壁細(xì)胞（如：急性分離的成年小鼠細(xì)胞，乳鼠細(xì)胞、成年大鼠的心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等）。

參考文獻(xiàn)：

Ang Y S , Rivas R N , Ribeiro A J S , et al. Disease Model of GATA4 Mutation Reveals Transcription Factor Cooperativity in Human Cardiogenesis[J]. Cell, 2016, 167(7):1734-1749.e22.