前沿熱點：心肌細胞舒張功能障礙模型的單細胞功能檢測
心血管疾病的機制研究一直是生物醫(yī)學研究的重點領域之一。近年來，隨著新技術的不斷涌現(xiàn)人們對心血管疾病發(fā)生與發(fā)展的機制認識不斷深化并極大地改善了臨床診療水平。而對于單心肌細胞興奮收縮偶聯(lián)機制以及病理生理狀態(tài)下心肌收縮舒張功能障礙的研究為我們在細胞學層面理解心肌疾病提供了重要的基礎。近期，斯坦福大學的研究者在《European Heart Journal》雜志發(fā)表了題為Modelling diastolicdysfunction in induced pluripotent stemcell-derived cardiomyocytes fromhypertrophic cardiomyopathy patients的研究論文，采用了新的視角去探索心臟疾病中心肌細胞的功能與疾病之間的聯(lián)系。
舒張功能障礙（Diastolic dysfunction，DD）是肥厚型心肌病（HCM）患者的顯著臨床特征也是導致肥厚型心肌病患者死亡的主要原因，表現(xiàn)為舒張期心室舒張緩慢或不完全。HCM患者發(fā)生心肌舒張功能障礙的具體細胞學機制尚不完全清楚，嚴重限制了臨床治療效果。
在以往的研究中，人們建立了多種HCM的動物模型(從嚙齒動物到大型動物)和疾病誘導方法。但是，由于種屬差異，動物模型的研究結(jié)果距離臨床應用相去較遠，急需人源化的研究手段。近年來，采用肥厚型心肌病患者來源的多能干細胞源性心肌細胞（iPSC-CM）在研究舒張功能障礙在肥厚型心肌病中的潛在機制以及新藥研發(fā)方面具有巨大潛力。
在該研究中，采用了Plexithermo HCell系列單心肌細胞功能檢測系統(tǒng)。首先通過外周血單核細胞重編程和誘導分化成功建立了舒張功能障礙的iPSC-CM細胞模型，該模型攜帶了家族性HCM中最常見的三種基因突變（即：肌球蛋白重鏈7， MYH7、肌球蛋白結(jié)合蛋白C3，MYBPC3和心肌肌鈣蛋白T2 ，TNNT2)。經(jīng)過細胞鑒定后進行舒張功能分析。與正常對照組iPSC-CM細胞相比，HCM iPSC-CM 組心肌細胞舒張期肌節(jié)長度明顯縮短；出現(xiàn)最大舒張速率降低和舒張時間延長而收縮速率未見變化。
圖1：肥厚型心肌病患者來源的多功能干細胞衍生分化心肌細胞出現(xiàn)舒張功能障礙。（A）iPSC-CMs的免疫熒光染色微陣列圖像，顯示排列的肌節(jié)結(jié)構。（B和C）采用過表達GFP-actin熒光顯示iPSC-CMs肌節(jié)，并通過活細胞共聚焦掃描獲得肌節(jié)收縮舒張圖像。（D-G）與正常對照iPSC-CMs組相比，HCM-iPSC-CM組出現(xiàn)舒張期肌節(jié)長度縮短（D）、最大肌節(jié)舒張長度（E）不變、最大舒張速率（F）減慢、90%舒張時間（G）延長。
細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)在心肌細胞興奮收縮偶聯(lián)中發(fā)揮至關重要的作用，該研究進一步通過Fura-2 AM熒光成像方法發(fā)現(xiàn)，與正常對照組iPSC-CM相比，HCM-iPSC-CM在舒張期心肌細胞內(nèi)[Ca2+] i水平顯著升高和出現(xiàn)Ca2+失穩(wěn)態(tài)，且在β-腎上腺素刺激下Ca2+失衡進一步加劇。同步觀察心肌細胞內(nèi)鈣瞬變和心肌收縮力結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCM-iPSC-CM的肌絲具有更強Ca2+敏感性（以dF/Δ[Ca2+]i衡量）。并且，通過CRISPR / Cas9對正常心肌細胞構建TNNT2 R92W突變或者對HCM-iPSC-CM的突變進行修正，均證實了肥厚性心肌病的基因突變可導致心肌出現(xiàn)舒張期鈣超載，鈣回攝減慢，肌絲鈣敏感性增強，最終損害HCM-iPSC-CM的舒張功能。
圖2：Fura-2AM熒光指示檢測HCM-iPSC-CMs舒張期細胞內(nèi)Ca2+。與Ctrl-iPSC-CMs相比， HCM-iPSC-CMs舒張期細胞內(nèi)Ca2+升高（B），Ca2+回攝顯著延長（C）。采用咖啡因誘發(fā)鈣瞬變發(fā)現(xiàn)HCM-iPSC-CMs的SR釋放更多的Ca2+，鈣瞬變衰減時間延長。
圖3：細胞功能成像顯示HCM-iPSC-CMs舒張功能障礙。同時記錄心肌細胞鈣瞬變和細胞收縮應力，與Ctrl-iPSC-CMs相比，HCM-iPSC-CMs的鈣瞬變幅值未發(fā)生顯著變化，但是鈣瞬變速率和肌絲鈣敏感性均增強。
圖4：β-腎上腺素處理加重HCM-iPSC-CMs舒張功能障礙。ISO處理進一步提高了HCM-iPSC-CMs中舒張期細胞內(nèi)Ca2+濃度，顯著延長了鈣瞬變衰減時間，加重細胞內(nèi)Ca2+異常失衡。雖然ISO處理對Ctrl-iPSC-CMs和HCM-iPSC-CMs的收縮節(jié)律均有提高，但HCM-iPSC-CMs組中出現(xiàn)更為嚴重的舒張期肌節(jié)長度縮短；舒張速率降低和舒張時間延長。
上述結(jié)果表明了Ca2+穩(wěn)態(tài)對HCM-iPSC-CM的舒張功能的重要作用，該研究進而采用Ca2+阻斷劑（10–200 nM verapamil 和 10–500 nM diltiazem)和晚期Na+通道阻斷劑（1–10 µM ranolazine 和 200nM to 1 µM eleclazine)處理可顯著改善HCM-iPSC-CM的心肌舒張功能，表現(xiàn)為縮短舒張期肌節(jié)長度，加快舒張速率，減少舒張時間；并顯著促進了HCM-iPSC-CM的存活。并且發(fā)現(xiàn)，與對照組iPSC-CM相比，HCM iPSC-CM中L型Ca2+通道（LTCC）和瞬時受體電位陽離子通道（TRPC1，3）的表達顯著增加，導致TRPC依賴的Ca2+內(nèi)流增強。這可能是導致HCM-iPSC-CM舒張期鈣超載的重要原因。
圖5：Ca2+阻斷劑和晚期Na+通道阻斷劑可改善HCM-iPSC-CMs鈣穩(wěn)態(tài)和舒張功能。Ca2+阻斷劑和晚期Na+通道阻斷劑處理可降低HCM-iPSC-CMs舒張期細胞內(nèi)Ca2+并縮短鈣瞬變；增加舒張期肌節(jié)長度和舒張速率，縮短舒張時間。
圖6：恢復鈣穩(wěn)態(tài)可顯著提高長時程β-腎上腺素刺激下的HCM-iPSC-CMs存活率。對HCM-iPSC-CMs中鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控的關鍵因子的表達水平進行分析發(fā)現(xiàn)Cav1.2,MYH7, NPPA和NPPB表達增加，MYH6,Casq2和Cav3表達降低。CaMKIId自磷酸化（pThr286）較Ctrl-iPSC-CMs明顯增強。通過Ca2+阻斷劑和晚期Na+通道阻斷劑處理可緩解上述異常，并且有效緩解長時程β-腎上腺素刺激導致的HCM-iPSC-CMs鈣超載和細胞死亡，有效提高HCM-iPSC-CMs的存活率。
圖7：采用患者來源的iPSC-CM模型揭示肥厚型心肌病舒張功能障礙的細胞機制示意圖。
該研究建立了一個新穎的平臺來研究基于HCM患者的iPSC-CM的舒張功能障礙的相關細胞學機制：首次在單細胞水平上證明了舒張期Ca2+超載和肌絲Ca2+敏感性增加均與HCM iPSC-CM的舒張功能障礙密切相關。此外，該研究還表明通過常用藥物治療（例如Ca2+通道阻斷劑和Na+通道阻滯劑）可以改善HCM-iPSC-CMs的舒張功能。該研究表明，基于HCM患者的 iPSC-CM 模型的功能成像分析和藥物檢測為心肌細胞病理生理學機制研究和發(fā)展?jié)撛诘腍CM治療策略提供了新的研究平臺。
參考文獻:
Haodi, W. , Huaxiao, Y. , June-Wha, R. , Zhang, J. Z. , Keung, L. C. , & Karim, S. , et al. (0). Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal(45), 45.
