Nat. Mater.：具有可調(diào)應(yīng)力松弛的水凝膠可調(diào)控干細(xì)胞的命運(yùn)及活性

       天然細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是粘彈性的并表現(xiàn)出應(yīng)力松弛，而用于合成3D培養(yǎng)所需ECMs的水凝膠通常是彈性的。美國(guó)研究人員Ovijit Chaudhuri等通過(guò)材料學(xué)方法，獨(dú)立于水凝膠的初始彈性模量、降解和細(xì)胞粘附配體密度，單獨(dú)調(diào)節(jié)了3D培養(yǎng)所用水凝膠的應(yīng)力松弛速率。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)于較快松弛速率水凝膠中的細(xì)胞鋪展、增殖和間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）成骨分化均得到增強(qiáng)。其中在初始彈性模量17kPa的快速松弛水凝膠中，MSC會(huì)形成類似于骨的礦化、富含膠原蛋白1的基質(zhì)。此外研究還發(fā)現(xiàn)應(yīng)力松弛的作用由粘附配體結(jié)合、actomyosin收縮性和粘附配體的機(jī)械聚集介導(dǎo)。研究成果強(qiáng)調(diào)了應(yīng)力松弛的重要性，它是細(xì)胞-胞外基質(zhì)相互作用的一個(gè)關(guān)鍵特征，也是細(xì)胞培養(yǎng)生物材料的一個(gè)重要設(shè)計(jì)參數(shù)。文章以“Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate andactivity”為題發(fā)表于Nature Materials。

背景

       由聚乙二醇（PEG）、藻酸鹽和透明質(zhì)酸等聚合物的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的水凝膠，常通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)到整合素結(jié)合配體（如RGD）用于3D細(xì)胞培養(yǎng)，或作為裝載細(xì)胞的生物材料埋植劑來(lái)促進(jìn)組織再生。相較于膠原、纖維蛋白等，這些水凝膠可實(shí)現(xiàn)獨(dú)立控制理化性質(zhì)（如基質(zhì)彈性、配體密度、孔隙度），以及在微尺度上的均勻性，因此常作為使用首選。然而除非水凝膠可隨時(shí)間降解，否則包括形狀變化、遷移和增殖在內(nèi)的一些正常細(xì)胞過(guò)程，在這些水凝膠中會(huì)受到抑制。雖然不可降解水凝膠可捕捉生理性ECM的一些特征，但通常幾乎是完全彈性的。相比之下重構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)（如膠原或纖維蛋白）和各種組織（如大腦、肝臟、脂肪組織、凝固的骨髓、初期骨折血腫或再生骨的軟骨痂）都是粘彈性的，并且在施加15%的恒定應(yīng)變時(shí)表現(xiàn)出部分應(yīng)力松弛（圖1a）。細(xì)胞在2D培養(yǎng)中一般產(chǎn)3-4%的應(yīng)力，在3D培養(yǎng)中產(chǎn)生20-30%的應(yīng)力。此外應(yīng)力松弛試驗(yàn)中測(cè)得的峰值應(yīng)力范圍為100-1000 Pa，完全在3D培養(yǎng)中細(xì)胞產(chǎn)生的應(yīng)力范圍內(nèi)。已知材料的機(jī)械特性可以調(diào)節(jié)粘附細(xì)胞的行為，基質(zhì)儲(chǔ)存（純彈性）或消散（粘彈性）細(xì)胞力的能力強(qiáng)烈暗示細(xì)胞與之有相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在使用水凝膠作為細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的情況下，改變基質(zhì)粘彈性（與基質(zhì)硬度無(wú)關(guān)）會(huì)對(duì)各種細(xì)胞行為產(chǎn)生影響。在表現(xiàn)出應(yīng)力松弛的凝膠中，細(xì)胞隨時(shí)間施加到基質(zhì)上的每一個(gè)力或應(yīng)變最初都受到一定的硬度抵抗，該硬度由初始彈性模量定義，隨后隨著時(shí)間的推移阻力減小。對(duì)于由弱交聯(lián)形成的水凝膠，松弛部分源于交聯(lián)的解結(jié)合及水凝膠流動(dòng)，因此細(xì)胞力可以機(jī)械地重塑基質(zhì)。本文研究了水凝膠粘彈性和應(yīng)力松弛對(duì)3D培養(yǎng)中細(xì)胞鋪展、增殖和MSC分化的影響。

結(jié)果

01-具有可調(diào)應(yīng)力松弛的水凝膠

       選擇多糖藻酸鹽（alginate）進(jìn)行水凝膠納米級(jí)結(jié)構(gòu)調(diào)整研究，以開(kāi)發(fā)一組應(yīng)力松弛速率廣泛但具有相似初始彈性模量的材料。雖然改變交聯(lián)化學(xué)物質(zhì)或聚合物濃度也可以改變水凝膠的應(yīng)力松弛特性，但研究人員開(kāi)發(fā)了一種材料學(xué)方法，可控制具有單一交聯(lián)劑類型和相同藻酸鹽濃度的水凝膠的應(yīng)力松弛速率。假設(shè)通過(guò)使用不同分子量的聚合物與不同交聯(lián)密度的鈣（與藻酸鹽離子交聯(lián)）結(jié)合，由于網(wǎng)絡(luò)中連接性和鏈移動(dòng)性的改變，可以調(diào)節(jié)所得水凝膠的應(yīng)力松弛性質(zhì)（圖1b）。由聚合物分子量降低引起的初始彈性模量的任何相關(guān)降低都可以通過(guò)增加交聯(lián)來(lái)補(bǔ)償。此外，假設(shè)短PEG spacer與藻酸鹽的共價(jià)偶聯(lián)將為藻酸鹽鏈的交聯(lián)提供空間位阻，并增強(qiáng)凝膠中的應(yīng)力松弛（圖1b）。這兩種方法都會(huì)改變單個(gè)聚合物鏈之間的凈親和力，從而有望控制松弛行為。因此研究人員通過(guò)將藻酸鹽的分子量從280 kDa降低到35 kDa，并且進(jìn)一步將5 kDa的PEG spacer偶聯(lián)到35 kDa藻酸鹽，證實(shí)應(yīng)力松弛的速率顯著提高（圖1c）。具體而言，將材料的初始應(yīng)力松弛至其一半的時(shí)間（τ1/2）從約1h調(diào)整至約1min，同時(shí)藻酸鹽聚合物濃度和初始凝膠彈性模量保持恒定（圖1c-e）。這些時(shí)間范圍與各種組織中測(cè)量的范圍類似（圖1a），且可與細(xì)胞行為時(shí)間相關(guān)聯(lián)。這些材料的應(yīng)力松弛行為遵循雙元素Maxwell-Weichert線性粘彈性模型。測(cè)量凝膠的頻率相關(guān)流變特性，發(fā)現(xiàn)隨著頻率降低，剪切儲(chǔ)能模量的降低速率更大，應(yīng)力松弛速率的增加與之相關(guān)。共聚焦熒光顯微鏡證實(shí)凝膠在微米尺度上是均勻的。另外在組織培養(yǎng)條件下，這些凝膠的機(jī)械性能和凝膠的干聚合物質(zhì)量在至少7天內(nèi)都是穩(wěn)定的（圖1f，g）。因此在這個(gè)時(shí)間尺度上，基質(zhì)的降解可以忽略不計(jì)。綜上所述，該方法可以單獨(dú)控制基質(zhì)應(yīng)力松弛的，與初始彈性模量和聚合物濃度無(wú)關(guān)，并且沒(méi)有水凝膠降解。

圖1 調(diào)整藻酸鹽水凝膠的納米級(jí)結(jié)構(gòu)，以獨(dú)立于初始彈性模量和基質(zhì)降解調(diào)節(jié)應(yīng)力松弛特性，從而獲得粘彈性行為。（a）交聯(lián)水凝膠（聚丙烯酰胺）、膠原凝膠、骨折血腫（人）和各種組織（大鼠）的應(yīng)力松弛試驗(yàn)。（b）降低鈣（紅色）交聯(lián)的藻酸鹽聚合物（藍(lán)色）的分子量如何降低網(wǎng)絡(luò)的糾纏與連接性（橙色箭頭），以及小spacer的耦合如何提供交聯(lián)區(qū)的空間間隔。（c）不同分子量藻酸鹽或與PEG spacer偶聯(lián)的低分子量藻酸鹽組成的凝膠的應(yīng)力松弛試驗(yàn)。（d）c中的τ1/2。應(yīng)力松弛的時(shí)間隨結(jié)構(gòu)的改變而顯著降低。（e）c中凝膠的初始模量測(cè)量。彈性模量間的差異不顯著。（f）培養(yǎng)1天或7天后藻酸鹽水凝膠的初始彈性模量。（g）培養(yǎng)1天或7天后藻酸鹽水凝膠的干質(zhì)量。

02-應(yīng)力松弛影響細(xì)胞鋪展和增殖

        用以上研究了3D培養(yǎng)中基質(zhì)應(yīng)力松弛速率對(duì)細(xì)胞鋪展和增殖的影響。3T3成纖維細(xì)胞封裝于RGD偶聯(lián)的藻酸鹽水凝膠中，水凝膠具有不同的應(yīng)力松弛速率，但初始彈性模量均約9 kPa（圖2a）。在應(yīng)力松弛時(shí)間較長(zhǎng)（τ1/2約1h）的材料中，細(xì)胞鋪展和增殖都受到抑制，且觀察到不可降解彈性水凝膠中典型的圓形細(xì)胞形態(tài)。隨著應(yīng)力松弛加快，細(xì)胞鋪展和增殖都隨之增加（圖2b，c）。當(dāng)RGD細(xì)胞粘附配體密度在松弛較快的凝膠中增加時(shí)，基質(zhì)應(yīng)力松弛對(duì)細(xì)胞鋪展和增殖的影響增強(qiáng)，表明應(yīng)力松弛的作用是通過(guò)基于整合素的粘附介導(dǎo)的（圖2d）。由于初始彈性模量和藻酸鹽濃度恒定，并且RGD細(xì)胞粘附配體密度也保持恒定在0、150或1,500 μm，因此細(xì)胞鋪展和增殖的增強(qiáng)僅歸因于應(yīng)力松弛的改變。在快速松弛水凝膠中觀察到細(xì)胞形狀的顯著變化表明，細(xì)胞對(duì)水凝膠進(jìn)行了機(jī)械重塑，由于水凝膠孔為納米級(jí)且不可降解，因此細(xì)胞形狀的變化和增殖必須通過(guò)基質(zhì)移動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

圖2 凝膠包裹的成纖維細(xì)胞中，鋪展和增殖隨著應(yīng)力松弛的加快而提高。（a）包裹在藻酸鹽凝膠中的3T3細(xì)胞。綠色為actin，藍(lán)色為細(xì)胞核。于培養(yǎng)7天后拍攝。（b）包含單個(gè)3T3細(xì)胞的最小邊界框的最長(zhǎng)尺寸的量化。細(xì)胞鋪展隨應(yīng)力松弛加快而顯著增加。（c）增殖細(xì)胞定量。增殖隨應(yīng)力松弛加快而增加。（d）在松弛時(shí)間為70或170s的藻酸鹽凝膠中，量化包含單個(gè)3T3細(xì)胞的最小邊界框的最長(zhǎng)尺寸，作為RGD密度的函數(shù)。細(xì)胞鋪展隨兩種凝膠中RGD濃度增加而顯著增加。

03-基質(zhì)應(yīng)力松弛調(diào)節(jié)MSC分化

       接下來(lái)觀察基質(zhì)應(yīng)力松弛對(duì)3D培養(yǎng)中小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞系（D1, MSC）分化的影響。已知封裝在離子交聯(lián)藻酸鹽水凝膠中的D1 MSC和原代人MSC，在1-10 kPa初始模量下主要向成脂分化，在11-30 kPa初始模量下主要向成骨分化。假設(shè)在初始彈性模量為11-30 kPa的基質(zhì)中，MSC的成骨分化將隨著凝膠中松弛的加快而減少。為了測(cè)試是否是這種情況，將MSC封裝在具有不同應(yīng)力松弛時(shí)間和初始彈性模量的藻酸鹽水凝膠中（圖3a、b）。當(dāng)基質(zhì)的初始彈性模量為約9 kPa時(shí)，MSC主要表現(xiàn)出成脂分化（中性脂質(zhì)染色），以及非常低水平的成骨分化（ALP染色和ALP活性定量分析），所有應(yīng)力松弛時(shí)間都是如此（圖3a，b），而在松弛時(shí)間約1min的快速松弛凝膠中，發(fā)現(xiàn)脂肪生成水平降低。相反，在約17 kPa的較高初始彈性模量時(shí)，沒(méi)有觀察到成脂分化，并且在應(yīng)力松弛較快的凝膠中成骨分化顯著增強(qiáng)（圖3a，b）。似乎細(xì)胞只是簡(jiǎn)單地隨著時(shí)間的推移整合基質(zhì)的彈性模量，隨著應(yīng)力松弛更快，成骨減少，成脂增加。更快的應(yīng)力松弛也促進(jìn)了MSC更大程度的鋪展。盡管細(xì)胞初始接種密度保持不變，但7天后較硬凝膠中的細(xì)胞密度似乎更高，這可能是由于成脂細(xì)胞和成骨分化細(xì)胞之間的增殖差異。此外在彈性模量9 kPa（成脂）和17 kPa（成骨）的緩慢松弛凝膠（如τ1/2為2,300s）中，MSC間的細(xì)胞形態(tài)相似；在應(yīng)力松弛時(shí)間2,300s和300s，17 kPa水凝膠中（成骨顯著增加），MSC的細(xì)胞形態(tài)也相似（圖3）。因此MSC的命運(yùn)與細(xì)胞的形狀是分離的，這與以前關(guān)于MSC在3D培養(yǎng)中分化的發(fā)現(xiàn)一致。

       除表征MSC的分化，還檢測(cè)了成骨分化干細(xì)胞的功能活性。已知在緩慢松弛的藻酸鹽凝膠、PEG凝膠、可降解的透明質(zhì)酸凝膠，或觸變性PEG硅膠的3D基質(zhì)中，MSC向成骨分化。然而尚無(wú)研究發(fā)現(xiàn)這些分化的細(xì)胞形成相互連接的、礦化的和富含Ⅰ型膠原的基質(zhì)（骨的三個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征）。本研究利用Von Kossa染色、免疫組化和能量色散x光光譜（EDS）顯示，應(yīng)力松弛較快條件下培養(yǎng)14天后，基質(zhì)礦化和Ⅰ型膠原沉積都得到增強(qiáng)（圖3c、d）。在應(yīng)力松弛時(shí)間約1min的快速松弛凝膠中，MSC形成相互連接的骨樣基質(zhì)，該應(yīng)力松弛時(shí)間接近早期骨折血腫的時(shí)間（圖1a）。這一結(jié)果表明，快速松弛凝膠不僅能促進(jìn)最大限度的成骨，還能使成骨分化的干細(xì)胞具有成骨活性。

圖3 MSCs向成骨分化并僅在快速松弛凝膠中形成相互連接的富含礦化Ⅰ型膠原的基質(zhì)。（a）油紅O（ORO）染色冷凍切片，（紅色）表示成脂分化，ALP染色（藍(lán)色）表示早期成骨分化。（b）ORO染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比定量，細(xì)胞裂解物中ALP活性定量。隨著應(yīng)力松弛的加快，成骨分化顯著增加。（c）培養(yǎng)2周后凝膠冷凍切片上Von Kossa（礦化）和Ⅰ型膠原染色。（d）培養(yǎng)2周后，凝膠切片的掃描電子顯微和SEM-EDS圖像。磷元素圖（紅色）覆蓋在相應(yīng)的反向散射SEM圖像上。

       在發(fā)現(xiàn)初始彈性模量和應(yīng)力松弛率對(duì)MSC分化和骨形成活性的強(qiáng)烈影響后，研究了快速應(yīng)力松弛促進(jìn)這些行為的潛在機(jī)制。鑒于細(xì)胞通過(guò)與胞外基質(zhì)配體的結(jié)合來(lái)感知胞外基質(zhì)中的機(jī)械信號(hào)，因此首先檢查了RGD密度對(duì)MSC分化的影響（圖4a）。在150 μm的較低RGD密度下，在初始彈性模量17 kPa的水凝膠中觀察到應(yīng)力松弛更快，成骨增強(qiáng)趨勢(shì)更強(qiáng)，但成骨分化的程度相對(duì)于較高RGD密度顯著降低（圖4a）。表明應(yīng)力松弛對(duì)成骨分化的影響是通過(guò)胞外基質(zhì)配體介導(dǎo)的。細(xì)胞通過(guò)整合素受體與細(xì)胞外基質(zhì)配體結(jié)合。使用識(shí)別抗體顯示在松弛更快的凝膠中，β1整聯(lián)蛋白向細(xì)胞外周的定位增加（圖4b）。但沒(méi)有觀察到樁蛋白paxillin在細(xì)胞周圍的定位，這表明在這種3D材料系統(tǒng)中，任何應(yīng)力松弛水平下都沒(méi)有形成常規(guī)的局部粘連。已知配體聚集與成骨分化相關(guān)，使用基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的技術(shù)評(píng)估RGD配體聚集。在包裹了細(xì)胞的快和慢松弛凝膠中，共聚焦顯微鏡分析偶聯(lián)到藻酸鹽上的熒光素-RGD和TAMRA-RGD間的FRET（圖4c，d）。在培養(yǎng)18h后，松弛較快凝膠中與MSC相鄰的水凝膠區(qū)域檢測(cè)到的能量轉(zhuǎn)移，相較松弛較慢凝膠程度更高（圖4e）。在快速松弛凝膠中，細(xì)胞周圍整個(gè)區(qū)域的FRET一般都是增強(qiáng)的。由于FRET信號(hào)可靈敏反應(yīng)供體和受體熒光團(tuán)之間的距離，證明了RGD配體的聚集，以及在松弛更快、初始彈性模量17kPa的水凝膠中，細(xì)胞對(duì)水凝膠的局部機(jī)械重塑。盡管在松弛更快、初始彈性模量9kPa的凝膠中，觀察到類似的RGD配體聚集增趨勢(shì)，但轉(zhuǎn)移程度顯著低于更硬的快速松弛凝膠。

       由于整合素的結(jié)合和聚集激活了信號(hào)通路，研究人員探究了不同應(yīng)力松弛水平的凝膠中，信號(hào)通路在介導(dǎo)成骨中的作用。已知細(xì)胞通過(guò)肌動(dòng)球蛋白收縮（通常激活Rho信號(hào)通路介導(dǎo)）感知胞外基質(zhì)的硬度，并通過(guò)激活Rac信號(hào)通路感知2D丙烯酰胺基質(zhì)的損失模量。對(duì)包裹于初始彈性模量17kPa水凝膠中的MSC，通過(guò)藥理學(xué)抑制myosin、Rho和Rac1。ML-7對(duì)myosin輕鏈激酶的抑制使成骨作用減少，表明快速應(yīng)力松弛基質(zhì)中成骨作用的增強(qiáng)涉及myosin的收縮性（圖4f）。Y-27632抑制Rho會(huì)促進(jìn)成骨（圖4g）。用NSC 23766抑制Rac1對(duì)成骨沒(méi)有顯著影響（圖4h）。

圖4 較硬水凝膠中，通過(guò)ECM配體密度、RGD配體聚集增加、myosin收縮性介導(dǎo)的MSC成骨分化。（a）包裹于水凝膠的MSC中ALP活性定量。（b）培養(yǎng)一周的MSC中，actin（綠色）、細(xì)胞核（藍(lán)色）和β1整合素（紅色）的免疫熒光染色。（c）RGD-熒光與RGD-羅丹明間的FRET分析。（d）培養(yǎng)18h后，不同應(yīng)力松弛特性水凝膠中，MSCs周圍水凝膠中的FRET受體信號(hào)（紅色）和細(xì)胞核（DAPI/藍(lán)色）的共焦顯微鏡圖像�？瞻�點(diǎn)表示細(xì)胞的位置。（e）細(xì)胞邊界2-3μm范圍內(nèi)，定量FRET受體信號(hào)的增強(qiáng)。（f）ML-7（myosin輕鏈激酶抑制劑）存在時(shí)MSC的ALP活性。（g）Y-27632（Rho激酶抑制劑）存在下，MSC的ALP活性。（h）NSC 23766（Rac1抑制劑）存在下，MSC的ALP活性。

       接下來(lái)檢查了YAP轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的核定位。YAP轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子被認(rèn)為是細(xì)胞機(jī)械或幾何應(yīng)答中，控制細(xì)胞基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)元件。已知2D丙烯酰胺基質(zhì)上培養(yǎng)的MSC在基質(zhì)硬度改變時(shí)，YAP的核定位可指導(dǎo)MSC分化為成脂或成骨細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)隨著應(yīng)力松弛更快，YAP的核易位增加，表明基質(zhì)應(yīng)力松弛對(duì)轉(zhuǎn)錄因子活性有影響。不同彈性模量間核YAP的水平變化的范圍相同（圖5a，b）。由于成脂分化主要在彈性模量約9kPa的基質(zhì)中觀察到，成骨分化主要在彈性模量約17kPa的基質(zhì)中觀察到，證明YAP的核易位與MSC命運(yùn)無(wú)關(guān)（圖5c，d）。表明在3D培養(yǎng)的MSC中，YAP的定位本身并不能控制細(xì)胞分化。

圖5 YAP核定位可通過(guò)較快的應(yīng)力松弛得到增強(qiáng)，但與MSC命運(yùn)無(wú)關(guān)。（a）培養(yǎng)一周的MSC中，免疫熒光染色actin（綠色）、細(xì)胞核（藍(lán)色）和YAP（紅色）。（b）核YAP與細(xì)胞骨架YAP濃度的定量比率。核YAP隨著更快的應(yīng)力松弛而顯著增加。（c）量化ORO染色陽(yáng)性的D1細(xì)胞百分比，作為相對(duì)核YAP的函數(shù)。（d）量化分化的D1細(xì)胞中ALP，作為相對(duì)核YAP的函數(shù)。

結(jié)論

       本研究展示了一種調(diào)節(jié)藻酸鹽水凝膠應(yīng)力松弛性質(zhì)的方法，并指出基質(zhì)應(yīng)力松弛對(duì)細(xì)胞生物學(xué)有深刻影響。強(qiáng)調(diào)了將基質(zhì)應(yīng)力松弛視為理解細(xì)胞-胞外基質(zhì)相互作用、機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)基礎(chǔ)生物物理學(xué)的基本信號(hào)是非常重要的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)生理性的細(xì)胞外基質(zhì)都表現(xiàn)出一定程度的應(yīng)力松弛。在組織工程應(yīng)用中，應(yīng)力松弛可作為一個(gè)材料設(shè)計(jì)參數(shù)，特別是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和促進(jìn)骨再生方面。

參考文獻(xiàn)：

Chaudhuri, O. , et al. "Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity." Nature Materials 15.3(2016):326-334.