Cell Rep.：納米機(jī)械刺激下，心肌細(xì)胞線粒體排列可調(diào)節(jié)鈣釋放

摘要

       臨床中，心力衰竭期間心律失常的發(fā)生是一個(gè)需要關(guān)注的問(wèn)題。區(qū)域電梯度引發(fā)心律失常，細(xì)胞離子跨膜梯度是其起源。英國(guó)和意大利研究人員Michele Miragoli等研究了衰竭心臟心肌細(xì)胞的納米級(jí)機(jī)械敏感特性是否與異常電活動(dòng)的啟動(dòng)有關(guān)。通過(guò)納米吸管產(chǎn)生液力噴射，在肌膜特定位置形成凹痕，啟動(dòng)胞內(nèi)鈣釋放。發(fā)現(xiàn)健康細(xì)胞中鈣僅限于局部區(qū)域，而衰竭心肌細(xì)胞中會(huì)傳播擴(kuò)散。心力衰竭使膜逐漸變硬并使肌膜下線粒體位移。秋水仙素處理可通過(guò)硬化細(xì)胞、破壞微管、移動(dòng)線粒體及引發(fā)鈣釋放來(lái)使健康細(xì)胞模擬衰竭。線粒體質(zhì)子梯度的解偶聯(lián)可消除衰竭細(xì)胞和秋水仙素處理細(xì)胞中的鈣啟動(dòng)。因此微管依賴的線粒體機(jī)械傳感因子微區(qū)的破壞，可能是心力衰竭時(shí)異常鈣釋放的一種機(jī)制。文章以“Microtubule-Dependent Mitochondria AlignmentRegulates Calcium Release in Response to Nanomechanical Stimulus in HeartMyocytes”為題發(fā)表于Cell Reports。

背景

       泵衰竭和心臟性猝死是臨床治療面臨的重要挑戰(zhàn)。心力衰竭時(shí)，機(jī)械敏感性的改變可引發(fā)電不穩(wěn)定和心律失常。使用原位完整心臟、離體心臟和離體細(xì)胞制劑，對(duì)促心律失常的機(jī)械電傳導(dǎo)已經(jīng)有了廣泛研究，但信號(hào)傳導(dǎo)及其啟動(dòng)所需的初始亞細(xì)胞機(jī)制仍不明確。已知肌節(jié)中，除產(chǎn)力之外還有些肌節(jié)蛋白可提供機(jī)械傳感和/或信號(hào)功能，這些肌節(jié)或Z盤復(fù)合蛋白的突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+應(yīng)答異常。

       心力衰竭時(shí)，細(xì)胞骨架重塑，可能會(huì)干擾機(jī)械感覺的正常調(diào)控，而缺乏適當(dāng)?shù)臋C(jī)械反饋控制可能會(huì)促進(jìn)心力衰竭發(fā)展。心力衰竭期間發(fā)生的結(jié)構(gòu)重塑涉及細(xì)胞膜（T小管缺失）、閏盤以及膜下微域，如蘭尼堿受體（RyRs）和肌質(zhì)網(wǎng)。已知心肌梗塞早期，胞內(nèi)線粒體位置、纖維間線粒體排列發(fā)生改變，而線粒體及二分體的規(guī)則排列在興奮-收縮偶聯(lián)和細(xì)胞內(nèi)鈣處理穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。關(guān)于線粒體重塑在機(jī)械電轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)的心律失常中的可能作用，我們了解甚少。因此許多傳統(tǒng)技術(shù)無(wú)法選擇性地機(jī)械激活或研究單個(gè)肌膜微結(jié)構(gòu)域內(nèi)的線粒體參與情況。本研究采用掃描離子電導(dǎo)顯微鏡（SICM）和表面共焦SICM來(lái)解決細(xì)胞拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和線粒體定位問(wèn)題。

       通過(guò)納米精度的SICM納米吸管施加壓力，研究心力衰竭時(shí)機(jī)械誘導(dǎo)鈣釋放的亞細(xì)胞機(jī)制（圖1）。健康心肌細(xì)胞中，以規(guī)則的Z-grooves為目標(biāo)的水力噴射，可引發(fā)機(jī)械誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣釋放（MiCai）事件，且MiCai空間受限。在Z-grooves不規(guī)則的衰竭心肌細(xì)胞中，MiCai則會(huì)傳播至整個(gè)細(xì)胞。產(chǎn)生傳播性MiCai的可能性與線粒體紊亂程度，以及施力點(diǎn)膜順應(yīng)性降低有關(guān)。排除機(jī)械敏感離子通道和肌動(dòng)蛋白絲后，觀察到可通過(guò)破壞健康心肌細(xì)胞中負(fù)責(zé)維持肌膜下線粒體位置的微管來(lái)模擬MiCai傳播。線粒體質(zhì)子梯度的解耦會(huì)消除MiCai傳播。似乎與線粒體相關(guān)的微管可能代表一個(gè)信號(hào)微區(qū)，可對(duì)肌膜機(jī)械刺激做出反應(yīng)。研究表明在心力衰竭進(jìn)展過(guò)程中，微管和線粒體紊亂在異常鈣釋放的啟動(dòng)中起著關(guān)鍵作用，為非動(dòng)作電位介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣釋放提供了一種解釋機(jī)制。

結(jié)果

01-衰竭心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與力學(xué)特性

       在心肌梗塞（MI）后不同時(shí)間點(diǎn)，使用SICM掃描正常和衰竭心肌細(xì)胞（主要來(lái)自代償性肥大，遠(yuǎn)離瘢痕區(qū)域）的肌膜結(jié)構(gòu)特征。根據(jù)拓?fù)鋱D像，將移液管定位于肌膜上200nm處定（嵴或Z-groove或無(wú)結(jié)構(gòu)區(qū)域）（圖1A）。隨后施加局部20kPa的水力噴射2s。水力噴射凹陷面積（圖1B）在0.125 μm2范圍內(nèi)。

圖1 實(shí)驗(yàn)方案示意圖。(A)5 μmol/L Fluo-4 AM處理細(xì)胞，SICM掃描細(xì)胞表面。納米管置于嵴或groove上方，保持200 nm距離不變，施加水射流壓力。根據(jù)Clampfit 10.0 (Molecular Devices)設(shè)置采集光閘(1-5KHz采集共8s)和壓力泵(20kPa持續(xù)2s)。記錄Fluo-4熒光發(fā)射(顏色編碼的延時(shí)圖)、Z向壓電位移(膜壓痕)和機(jī)械誘導(dǎo)的鈣起始及傳播。右為壓力、Z向壓電位移和鈣瞬態(tài)讀數(shù)距離。(B)離體心肌細(xì)胞中，20 kPa水射流壓力2s后的擾動(dòng)區(qū)域。移液管填充1mM熒光黃，得到約0.125μm2區(qū)域(綠點(diǎn))，插圖為放大。

       以大鼠為模型研究心肌梗塞后發(fā)展為心力衰竭的心肌細(xì)胞，模型在16周出現(xiàn)心力衰竭，有明顯的肥厚及左心室衰竭。首先獲得正�；蛩ソ咝募〖�(xì)胞10×10μm大小的SICM拓?fù)鋱D像，用于量化表面結(jié)構(gòu)規(guī)則性的破壞情況，可見肌膜規(guī)則性逐漸改變（圖2A）。測(cè)量心肌梗塞后16周的Z-groove指數(shù)，發(fā)現(xiàn)從對(duì)照心肌細(xì)胞的0.62±0.16顯著降低到0.44±0.19（圖2B）。因此心肌梗塞后，膜組織發(fā)生了實(shí)質(zhì)性的改變，包括嵴（crests）和溝（grooves）的消失。

       為研究細(xì)胞表面微區(qū)的機(jī)械特性，在細(xì)胞光滑或溝區(qū)施加0-40kPa（通常20kPa）水力噴射2s，記錄移液管的垂直位移。移液管由SICM反饋控制機(jī)制驅(qū)動(dòng)，隨細(xì)胞表面移動(dòng)，記錄膜位移（Z向）與壓力做函數(shù)。發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞中，溝周圍區(qū)域比嵴處硬，施加相同壓力移液器位移更少，但衰竭的細(xì)胞哪個(gè)區(qū)域的膜都比較硬（圖2D）。

       心力衰竭發(fā)展期間，心肌梗塞后4周細(xì)胞表面規(guī)律性開始發(fā)生變化，但不明顯（圖2A和2C）。肌膜的膜順應(yīng)性顯著減少（圖2D）。8周時(shí)結(jié)構(gòu)逐漸喪失，肌膜比對(duì)照細(xì)胞更硬。水力噴射后的膜順應(yīng)性數(shù)據(jù)計(jì)算彈性楊氏模量，發(fā)現(xiàn)整個(gè)肌細(xì)胞表面的模量變化很大（圖2D）。

圖2 向心力衰竭發(fā)展時(shí)，MiCai傳播從局部向整體變化。（A）左上為AMC心肌細(xì)胞表面；右上為心力衰竭細(xì)胞；左下為MI 8周的細(xì)胞；右下為MI 16周。（B）向心力衰竭發(fā)展期間MiCai傳播頻率。（C）Z-groove指數(shù)。（D）20kPa壓力施加2s后的膜順應(yīng)性。

02-衰竭心肌細(xì)胞中的MiCai

       健康的對(duì)照心肌細(xì)胞中，施加于Z-groove的壓力啟動(dòng)了局部MiCai，特征是擴(kuò)散相對(duì)緩慢，并且空間上局限于壓力部位（圖3A左）。而在衰竭心肌細(xì)胞中，MiCai始于壓力部位并傳播擴(kuò)散至整個(gè)細(xì)胞（圖3A右）。衰竭細(xì)胞中MiCai傳播更快（達(dá)到峰值的時(shí)間更短），對(duì)照心肌細(xì)胞主要表現(xiàn)為局部MiCai，達(dá)到峰值總時(shí)間為252.4±11ms，而衰竭心肌細(xì)胞主要為傳播性MiCai，到達(dá)峰值時(shí)間為134±26ms（圖3B）。研究MiCai的特征和動(dòng)力學(xué)發(fā)現(xiàn)，衰竭細(xì)胞中的MiCai事件的持續(xù)時(shí)間比對(duì)照細(xì)胞長(zhǎng)，且振幅更高（圖3B）。隨著心肌梗死后細(xì)胞重塑并向心力衰竭發(fā)展，MiCai傳播的概率和頻率增加。心肌梗塞后4周，傳播性MiCai的出現(xiàn)頻率只是略高于對(duì)照，而心肌梗塞后8周，液力噴射后傳播出現(xiàn)的頻率更高（圖2B）。

       通常衰竭的心肌細(xì)胞表現(xiàn)出兩種不同的MiCai起始和傳播模式。一重是出現(xiàn)一個(gè)孤立的“波紋”，從壓力點(diǎn)下方開始并逐漸傳播至整個(gè)細(xì)胞，發(fā)生在心肌梗塞后4、8和16周的所有時(shí)間點(diǎn)。另一種更為復(fù)雜，MiCai波從壓力點(diǎn)下方開始，但1或2ms后，會(huì)有一個(gè)或多個(gè)來(lái)自細(xì)胞外圍的遠(yuǎn)程MiCai信號(hào)（二進(jìn)制出現(xiàn)）跟隨初始波。隨后三重Ca2+波正面碰撞并快速傳播至整個(gè)細(xì)胞。

03-MiCai起始與L型鈣通道、肌漿網(wǎng)、拉伸激活通道或肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架無(wú)關(guān)

       從0到低（0.1μmol/L）再到“生理水平”（1.8μmol/L）改變胞外Ca2+濃度，發(fā)現(xiàn)不會(huì)影響MiCai頻率。硝苯地平處理（抑制鈣內(nèi)流）也未能阻止MiCai發(fā)生（圖3C左下）�？Х纫颍≧yR激動(dòng)劑）處理發(fā)現(xiàn)，盡管高劑量咖啡因會(huì)使RyR2打開，但不會(huì)改變正常和衰竭細(xì)胞中已傳播MiCai的頻率（圖3C上）。其他可能觸發(fā)MiCai的機(jī)械因素方面，液力噴射會(huì)在細(xì)胞膜上形成凹痕并使膜發(fā)生拉伸，用100μmol/L鏈霉素或30μmol/L釓（Gd3+）抑制拉伸激活通道，未能消除壓力部位下的MiCai起始，表明主要的局部機(jī)械傳感因子與拉伸激活通道無(wú)關(guān)。鑒于肌節(jié)與骨骼肌間costamere處的許多蛋白質(zhì)是肌動(dòng)蛋白結(jié)合的機(jī)械傳感蛋白質(zhì)，因此用5μmol/L細(xì)胞松弛素D處理2h，破壞AMC細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白微絲，使心肌細(xì)胞肌膜變硬并阻斷收縮，但也沒有改變MiCai事件的發(fā)生率或Z-groove比率。

圖3 向心力衰竭發(fā)展時(shí)，MiCai傳播從局部向整體變化。（A）AMC和MI后16周衰竭細(xì)胞的傳播時(shí)間圖。（B）AMC和衰竭細(xì)胞中機(jī)械誘導(dǎo)的鈣瞬變（MiCai）參數(shù)。（C）基線以及咖啡因、硝苯地平、CCCP和CsA存在下，AMC細(xì)胞中的MiCai頻率。

04-心力衰竭期間線粒體的重排與觸發(fā)MiCai相關(guān)

       細(xì)胞外鈣參與的缺乏表明存在細(xì)胞內(nèi)Ca2+源。已知線粒體參與壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，因此采用共聚焦顯微鏡結(jié)合SICM和透射電子顯微鏡（TEM），研究衰竭細(xì)胞中二分體和線粒體之間的相互作用。在正常對(duì)照心肌細(xì)胞中，活躍的TMRM標(biāo)記線粒體周期性排列與嵴對(duì)齊，反映出Z-grooves和T小管開口排列規(guī)則（圖4）。心力衰竭細(xì)胞中線粒體失去組織規(guī)律性，似乎也變長(zhǎng)（圖4右），碎片變少，線粒體平均面積增加。分別用CCCP和環(huán)孢菌素A（CsA）抑制線粒體質(zhì)子梯度和通透性轉(zhuǎn)換孔，發(fā)現(xiàn)消除了衰竭細(xì)胞中傳播的MiCai（圖3C右下）。表明線粒體在該過(guò)程中起著積極的作用。因此線粒體紊亂與MiCai傳播的發(fā)生相關(guān)，重塑線粒體微結(jié)構(gòu)域在MiCai起始中可能起積極作用。

圖4 MI引發(fā)的二元微區(qū)重構(gòu)以線粒體位移為特征。左列：對(duì)照AMC；右列：心衰細(xì)胞（MI后16周）。從上至下依次為：SICM表面拓?fù)鋱D像；TMRM標(biāo)記線粒體；SICM細(xì)胞拓?fù)浜捅砻婀簿劢谷诤蠄D；心衰時(shí)線粒體重組的透射電子顯微圖。

05-微管網(wǎng)絡(luò)紊亂是線粒體位移的原因

       有研究發(fā)現(xiàn)微管參與MiCai和Ca2+i火花產(chǎn)生。用10μmol/L秋水仙素干擾微管聚合（圖5）。秋水仙素對(duì)表面Z-groove結(jié)構(gòu)（Z-groove指數(shù)，處理前0.61±0.04，處理后0.63±0.05）或T小管密度都沒有影響。但秋水仙素和諾考達(dá)唑處理都使T小管規(guī)則性和膜順應(yīng)性顯著降低。秋水仙素處理后的細(xì)胞，液力噴射對(duì)嵴施壓，會(huì)使69%細(xì)胞引發(fā)MiCai，而對(duì)照AMC細(xì)胞（沒有秋水仙素處理）中，這一比例為12%（圖5A）。然而秋水仙素加CCCP（圖5C）或秋水仙素加CsA組合處理都能夠完全消除這種效應(yīng)。共聚焦和TEM顯示對(duì)照組中，秋水仙素使肌膜下線粒體發(fā)生了位移（圖5B右），線粒體平均面積增加，類似心力衰竭細(xì)胞。即使在正常細(xì)胞中，秋水仙素也會(huì)使膜變硬（圖5D），并產(chǎn)生與心力衰竭時(shí)相似的膜順應(yīng)性。表明微管網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)使線粒體發(fā)生移動(dòng)，這是MiCai易感的關(guān)鍵機(jī)制。

       已知β-tubulin在很大程度上與包括線粒體在內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞器共定位。因此在秋水仙素處理的細(xì)胞中研究線粒體移位及其重新定位與微管紊亂之間的關(guān)系。免疫細(xì)胞化學(xué)分析表明，秋水仙素顯著破壞了AMC細(xì)胞（圖5B）和心力衰竭細(xì)胞中的心肌細(xì)胞β-tubulin。已知心力衰竭細(xì)胞中微管蛋白網(wǎng)絡(luò)異常，qPCR對(duì)mRNA表達(dá)分析證實(shí)了α1A-tubulin（TUBA1A）、β2B-tubulin（TUB2B）、β3-tubulin（TUBB3）、γ-1 tubulin（TUBG1）和tubulin相關(guān)蛋白（MAP4）的表達(dá)總體增加。以上這些均與微管動(dòng)力學(xué)的改變有關(guān)。完全破壞衰竭心肌細(xì)胞的微管網(wǎng)絡(luò)（秋水仙素處理）并沒有消除MiCai，也不會(huì)顯著影響膜順應(yīng)性。

圖5 破壞微管會(huì)導(dǎo)致MiCai發(fā)生頻率更高。（A）MiCai時(shí)間進(jìn)程圖。上，20kPa沒有產(chǎn)生MiCai；下，10μmol/L秋水仙素36℃孵育1h，20kPa表現(xiàn)出MiCai傳播。（B）T小管（綠色）和β-tubulin（紅色）染色。最右電子顯微鏡圖片為10μmol/L秋水仙素孵育1h后AMC細(xì)胞中染色體移動(dòng)。（C）不同處理下的MiCai傳播頻率。（D）秋水仙素和CCCP處理的AMC中嵴和溝處的膜順應(yīng)性。

06-人衰竭DCM細(xì)胞中的MiCai

       利用擴(kuò)張型心肌�。―CM）患者的心肌細(xì)胞研究人心肌細(xì)胞的MiCai發(fā)生率。SICM成像揭示了拓?fù)洚愘|(zhì)性（圖6A），與之前觀察到的衰竭大鼠心肌細(xì)胞類似。施加壓力后65%發(fā)生MiCai傳播（圖6B和6C），主要為壓力施加在非橫紋、較硬的區(qū)域時(shí)（圖6D），可模擬大鼠心力衰竭模型。與大鼠衰竭細(xì)胞類似，人DCM細(xì)胞中α1C-tubulin（TUBA1C）、β2A-tubulin（TUBB2A）、TUBB3、TUBG1和MAP4較非衰竭心肌細(xì)胞顯著上調(diào)，表明微管瓦解在細(xì)胞MiCai易感中起主要作用（圖6E）。

圖6 人DCM心肌細(xì)胞中MiCai的出現(xiàn)情況。（A）人心衰心肌細(xì)胞的膜。（B）MiCai傳播時(shí)間圖。（C）熒光示蹤MiCai。（D）人心衰細(xì)胞中傳播MiCai的頻率。（E）與非心衰心肌細(xì)胞相比，DCM心肌細(xì)胞中微管蛋白mRAN上調(diào)。

結(jié)論

       本研究結(jié)合SICM，描繪了單個(gè)細(xì)胞中機(jī)械引發(fā)的脈沖傳播，能夠以納米精度識(shí)別并定位活細(xì)胞（特別是心肌細(xì)胞）中的功能性機(jī)械感應(yīng)。得到的數(shù)據(jù)表明，衰竭會(huì)改變肌膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和機(jī)械特性，破壞膜結(jié)構(gòu)規(guī)律性、使順應(yīng)性降低（變硬）。由心力衰竭衍生的心肌細(xì)胞中，由于細(xì)胞膜硬度較高、微管網(wǎng)絡(luò)異常，會(huì)將局部納米機(jī)械應(yīng)力產(chǎn)生的局部性、線粒體依賴性的Ca2+釋放轉(zhuǎn)變?yōu)閭鞑バ訡a2+釋放，從而啟動(dòng)細(xì)胞范圍內(nèi)的Ca2+波傳播。另外微管網(wǎng)絡(luò)破壞是MiCai傳播的先決條件，線粒體重排也與觸發(fā)MiCai有關(guān)，而LTCC和肌質(zhì)網(wǎng)等鈣源與MiCai的產(chǎn)生無(wú)關(guān)。鑒于多細(xì)胞水平下的胞內(nèi)Ca2+波可促進(jìn)心律失常的發(fā)生，本文描述的機(jī)制可能解釋了部分異位起始和傳播引發(fā)心律失常的機(jī)制。不僅從機(jī)械方面加深了理解，也為臨床提供了新的治療靶點(diǎn)。此外，膜順應(yīng)性的改變可能成為一個(gè)潛在的臨床標(biāo)志，通過(guò)改變力的傳遞從而改變鈣含量。

參考文獻(xiàn)：

Miragoli, M. , et al. "Microtubule-Dependent Mitochondria Alignment Regulates Calcium Release in Response to Nanomechanical Stimulus in Heart Myocytes." Cell Reports 14.1(2016):140-151.