活體成像：花青偶聯(lián)物用于癌癥治療診斷學(xué)的研究

花青染料（cyanine）作為構(gòu)建熒光探針的重要核心，還具有一定的光療潛力。此外，cyanine與其他治療劑偶聯(lián)（共價結(jié)合），不僅可以提高治療效果，而且拓寬了對于治療模式的選擇。我們此前曾分享過北京大學(xué)戴志飛教授團隊關(guān)于cyanine用于生物醫(yī)學(xué)影像探針研究的綜述性文章（詳情請見 花青偶聯(lián)物用于生物醫(yī)學(xué)影像探針的研究 ）。在此基礎(chǔ)上，戴教授團隊進一步關(guān)注了cyanine-治療劑偶聯(lián)物在癌癥治療診斷學(xué)中運用的進展，并進行了詳細(xì)的分類與整理，希望此次的分享能夠為相關(guān)領(lǐng)域科研工作者們的研究提供助益。

• 癌癥治療診斷學(xué)的概念

異質(zhì)性、轉(zhuǎn)移性和治療抵抗等因素的共同作用，使癌癥成為世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的一種主要疾病。為應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，研究人員逐步開發(fā)出一種將“診斷成像”與“治療干預(yù)”相結(jié)合的新型模式，稱為癌癥治療診斷學(xué)，要求治療診斷試劑應(yīng)當(dāng)作為一個獨立的集成系統(tǒng)，同時具備治療和診斷能力。這樣的系統(tǒng)通常由治療劑和造影劑組成，有時還會進一步添加用以增強腫瘤靶向效果的“彈頭”。除具備基本的治療效果外，該系統(tǒng)還可以從復(fù)雜的生物系統(tǒng)中提取實時診斷信息，因此具有令人期待的應(yīng)用前景。

cyanine是聚甲炔染料家族的一個子類，與其他熒光染料相比，具有高摩爾吸收率、窄吸收/發(fā)射帶、紫外/可見光（UV/Vis）及近紅外（NIR）范圍的光譜分布，優(yōu)良的生物相容性和低毒性等優(yōu)點。具備光轉(zhuǎn)換能力的cyanine本身可作為光療劑用于研究。而與其他強效治療劑偶聯(lián)，則可進一步提高藥物的治療效果，拓寬治療模式。當(dāng)需要在生命系統(tǒng)中發(fā)揮作用、特別是需要進行體內(nèi)表征時，最好選擇NIR生物窗范圍（> 650 nm）發(fā)射的cyanine用于偶聯(lián)，因為該波段的熒光信號具有深層組織穿透性、光毒性較小、光散射減少以及自發(fā)熒光最小等固有優(yōu)勢。

在cyanine-治療劑偶聯(lián)物中，cyanine主要作為診斷工具來發(fā)揮作用。根據(jù)偶聯(lián)物的治療模式，可將其分為化療、光療和靶向治療等類型，此外還包括可用于遞送治療劑的cyanine納米載體等，分述如下。

化療是一種利用抗癌藥物（化療藥物）治療癌癥的傳統(tǒng)方法。抗癌藥物的抗腫瘤作用源于對快速分裂細(xì)胞的毒性，因為腫瘤通常以不受控制的增殖為特征。由于無法區(qū)分其他快速分裂細(xì)胞（非選擇性），化療可引起惡心、嘔吐、骨髓抑制、脫發(fā)等諸多不良反應(yīng)。為避免這些缺陷，將抗癌藥物與具有腫瘤親和性的七甲炔cyanine偶聯(lián)、用于腫瘤靶向遞送是一種合理的解決辦法。在治療過程中，cyanine-化療劑偶聯(lián)物還可以提供評估化療狀態(tài)的信息。

目前，已報道的可用于cyanine偶聯(lián)物配方的化療藥物有：抗代謝藥（如，甲氨蝶呤、吉西他濱），烷化劑（如，氮芥、順鉑、替莫唑胺），拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑（如，喜樹堿），有絲分裂抑制劑（如，紫杉醇）等。其結(jié)合過程通常會利用藥物分子上的先天反應(yīng)基團來促進生物相容性酯或酰胺鍵的形成。

此外，通過在腫瘤部位給與內(nèi)部或外部刺激，選擇性激活前體藥物的策略，可以達到降低脫靶毒性和提高化療效果的目的。內(nèi)部刺激，包括腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境中固有的條件，如低pH、缺氧、ROS、過度表達的酶等；外部刺激，包括人為施加的光照、溫度等條件。

以前體藥物策略設(shè)計cyanine-化療劑偶聯(lián)物，可將其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂?ldquo;應(yīng)激性”的治療診斷劑（在正常組織中保持無活性，在腫瘤部位被激活并分解釋放藥物），如此一來，不僅可以起到可控的化療效果，還可以監(jiān)測藥物的生物分布和活化情況。

cyanine染料在偶聯(lián)和非偶聯(lián)狀態(tài)下會表現(xiàn)出不同的光譜特征，更加支持了利用前體藥物進行激活/監(jiān)測的機制。例如，GSH水平在各種癌癥中升高的特點，經(jīng)常被用作前體藥物設(shè)計中的內(nèi)部刺激因素，可以此來設(shè)計能夠被GSH切割的二硫鍵接頭結(jié)構(gòu)：如，將IR780通過含二硫鍵的接頭與甲氨蝶呤偶聯(lián)，在GSH促進裂解后，cyanine和甲氨蝶呤之間的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移被破壞，導(dǎo)致654 nm處的初始峰消失，在802 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，而750nm處的熒光峰也會轉(zhuǎn)移到808 nm處。因此可對其同時進行生物分布（λex = 640 nm ）和生物活化（λex = 745 nm ）的監(jiān)測。對其他指標(biāo)的分析表明，與單獨的甲氨蝶呤相比，該前體藥物具有更加優(yōu)異的腫瘤靶向能力和更好的抗腫瘤效果。

圖1. 靜脈注射偶聯(lián)藥物后，在指定時間點、通過生物分布(640 nm)和活化(745 nm)通道分別監(jiān)測MCF-7異種移植小鼠模型的體內(nèi)NIRF成像（左）以及正常器官和腫瘤的離體NIRF成像（右）結(jié)果。

另一方面，在一些設(shè)計中，利用光照可以使藥物從cyanine偶聯(lián)物中釋放，有利于對前體藥物的激活進行控制。NIR光因其深層組織穿透力和最小的光細(xì)胞毒性而尤其適合應(yīng)用此策略。例如，一種基于光裂解cyanine支架進行藥物釋放的籠狀喜樹堿前體藥物，其聚甲炔鏈發(fā)生光氧化裂解，誘導(dǎo)籠狀鏈發(fā)生自我消解并最終釋放藥物。通過820 nm發(fā)射光通道可追蹤前體藥物的生物分布；而在680 nm光照下，前體藥物發(fā)生分解，產(chǎn)生535 nm的新發(fā)射峰，可用于評估藥物的活化狀態(tài)。

圖1. 靜脈注射偶聯(lián)藥物后，在指定時間點、通過生物分布(640 nm)和活化(745 nm)通道分別監(jiān)測MCF-7異種移植小鼠模型的體內(nèi)NIRF成像（左）以及正常器官和腫瘤的離體NIRF成像（右）結(jié)果。

另一方面，在一些設(shè)計中，利用光照可以使藥物從cyanine偶聯(lián)物中釋放，有利于對前體藥物的激活進行控制。NIR光因其深層組織穿透力和最小的光細(xì)胞毒性而尤其適合應(yīng)用此策略。例如，一種基于光裂解cyanine支架進行藥物釋放的籠狀喜樹堿前體藥物，其聚甲炔鏈發(fā)生光氧化裂解，誘導(dǎo)籠狀鏈發(fā)生自我消解并最終釋放藥物。通過820 nm發(fā)射光通道可追蹤前體藥物的生物分布；而在680 nm光照下，前體藥物發(fā)生分解，產(chǎn)生535 nm的新發(fā)射峰，可用于評估藥物的活化狀態(tài)。

圖3. 將IR-808與PEG/BPEI雙功能化的NGO結(jié)合得到偶聯(lián)物，右圖顯示其在腫瘤靶向成像和協(xié)同光療中的效用。

靶向治療：cyanine作為偶聯(lián)接頭

分子生物學(xué)和泛組學(xué)分析（如基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)）的進步，有助于識別癌細(xì)胞中各種異常或過度表達的分子靶標(biāo)。針對這些靶標(biāo)進行藥物設(shè)計，可以特異性地阻斷腫瘤進展并減少不良反應(yīng)，這構(gòu)成了靶向治療的概念。

目前已有許多腫瘤相關(guān)靶點得到驗證并用于藥物研發(fā)。對于這些靶點，有兩種主要類型的靶向治療物可用于cyanine偶聯(lián)，包括單克隆抗體（mAb）和小分子抑制劑。其中，cyanine-mAbs偶聯(lián)物在相關(guān)報道中主要作為熒光探針用于靶向分子成像。另一方面，將源自mAb的抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）與cyanine結(jié)合成為治療診斷劑，正逐漸成為新的研究亮點。

在ADC中，抗體作為靶向彈頭，用于準(zhǔn)確地遞送化療藥物。通常，偶聯(lián)結(jié)構(gòu)中的接頭對于ADC的性能有著至關(guān)重要的作用，需要具備兩個基本特性：①在體循環(huán)中保持穩(wěn)定，以避免脫靶藥物釋放；②在ADC內(nèi)化時快速切割以釋放藥物。將cyanine骨架作為ADC結(jié)構(gòu)中的接頭是一種開創(chuàng)性的設(shè)計思路，可以通過NIR光觸發(fā)的光氧化裂解實現(xiàn)對于藥物的按需釋放。


圖4. NIR光觸發(fā)藥物從ADC中釋放的機制，其中七甲炔cyanine作為接頭。將A431腫瘤植入小鼠背部兩側(cè)，注射偶聯(lián)藥物兩天后，僅對左側(cè)腫瘤進行不同劑量的690 nm光照射，活體NIRF成像結(jié)果如圖所示。
另一方面，小分子抑制劑通常會中斷細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這種抑制作用主要是由于其占據(jù)了目標(biāo)蛋白的功能域。大多數(shù)小分子抑制劑靶向蛋白激酶，如達沙替尼就是一種臨床可用的酪氨酸激酶抑制劑（TKI），可用于治療慢性粒細(xì)胞白血病和急性淋巴細(xì)胞白血病。利用達沙替尼構(gòu)建的cyanine偶聯(lián)物，可以增強藥物向腫瘤靶向遞送的效果。

cyanine偶聯(lián)物作為納米載體

與上述直接和治療劑結(jié)合的情況相比，cyanine還可以被選擇性地制成納米載體偶聯(lián)物，用于傳遞治療劑，包括化療劑、基因等。根據(jù)納米載體的結(jié)構(gòu)和組成，可以通過靜電/疏水相互作用、共價或非共價的方式來固定或封裝藥物。這些納米治療劑具有顯著的腫瘤選擇性，包括被動靶向、通過配體介導(dǎo)的相互作用進行主動靶向，以及通過內(nèi)在或外在刺激觸發(fā)藥物釋放。

多樣化的納米載體平臺，也為cyanine的偶聯(lián)提供了巨大的可能性，例如，將cyanine染料與親水聚合物分子偶聯(lián)，在水溶液中可自組裝為雙層納米粒子結(jié)構(gòu)，可有效地裝載甲氨蝶呤（包封率＞40%），并表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性。

在腫瘤靶向基因遞送方面，有研究團隊構(gòu)建了一種IR783-b2kPEI偶聯(lián)物作為熒光納米載體，其中聚陽離子PEI支架負(fù)責(zé)與帶負(fù)電荷的核酸產(chǎn)生互作。該載體顯示出良好的向核胞內(nèi)轉(zhuǎn)運特性，并被認(rèn)定為是一種有效的腫瘤靶向轉(zhuǎn)染劑，可在小鼠異種移植模型中同時檢測NIRF信號以及通過熒光素酶監(jiān)測基因表達。

圖5. IR783-b2kPEI偶聯(lián)物與表達熒光素酶的pGL3質(zhì)粒復(fù)合，用于轉(zhuǎn)染G361腫瘤異種移植小鼠；尾靜脈注射該復(fù)合物后24 h，對解剖腫瘤進行NIRF成像（上圖）和生物發(fā)光成像（下圖）。

技術(shù)展望
      通過戴教授及其團隊成員的辛勤工作，我們可以較為清晰地了解到目前已有的、可參與癌癥治療診斷系統(tǒng)偶聯(lián)設(shè)計的治療劑及其相應(yīng)的偶聯(lián)策略，在此表示誠摯的感謝！
      在利用熒光成像技術(shù)進行癌癥治療診斷系統(tǒng)研發(fā)的過程中，熒光信號的有限穿透深度降低了大多數(shù)cyanine偶聯(lián)物的診斷價值。此外，cyanine的光穩(wěn)定性較差，無法進行長時間實時監(jiān)測等阻礙，使其更適合在連續(xù)時間點內(nèi)進行成像。另一方面，對于傳統(tǒng)的平面熒光成像結(jié)果，其有效性會受到z軸信息不足的影響。因此，研究人員還需要利用更加先進的成像技術(shù)來解決上述問題。
       對此，戴教授著重提到了一種新型的“臨床前多模態(tài)活體成像平臺FLECT/CT”，將其作為優(yōu)秀的下一代成像解決方案予以介紹：該成像平臺可以在單次采集的過程中，同步收集活體小鼠的CT和熒光數(shù)據(jù)，以進行全角度的3D斷層成像，使研究人員可以最大限度地利用從成像結(jié)果中獲取的信息。





圖6. FLECT/CT系統(tǒng)利用激光激發(fā)已進行NIR標(biāo)記的樣品，以探測器環(huán)環(huán)繞的方式在樣品周圍收集發(fā)射光信號。隨著機體位置的不斷改變，完成從單層采集到3D采集再到重建與可視化分析的全方位掃描過程。同軸一體的CT模塊為光學(xué)信號提供精確的解剖學(xué)參考。

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