活體成像技術(shù)：花青偶聯(lián)物用于生物醫(yī)學(xué)影像探針的研究

花青（cyanine）是一類具有靈活特性的熒光染料，將cyanine與其他功能分子進(jìn)行偶聯(lián)（共價綴合）代表了一類獨(dú)特的設(shè)計(jì)策略，在基礎(chǔ)和臨床成像研究中具有巨大的應(yīng)用潛力�；�于此，北京大學(xué)工學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系戴志飛教授團(tuán)隊(duì)，對最近7年發(fā)表的文獻(xiàn)中關(guān)于運(yùn)用cyanine偶聯(lián)策略進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)影像探針研發(fā)所取得的進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)。我們在此選擇一些比較有代表性的概念及成果與大家進(jìn)行分享：

基于cyanine的熒光探針優(yōu)勢

幾種商品化的花青染料（cyanine dyes），如噻唑橙（Thiazole Orange，TO）、Cy5.5、吲哚菁綠（Indocyanine Green，ICG）、IRDye800-CW、ZW800-1，已被成功開發(fā)出來（見圖1），廣泛用于科學(xué)研究。

圖1：常用cyanine dyes化學(xué)結(jié)構(gòu)，紅色標(biāo)記原子表示用于綴合的反應(yīng)基團(tuán)。

目前，已有大量圍繞cyanine dyes作為熒光骨架而展開的結(jié)構(gòu)修飾與功能化研究，以提高其整體的熒光性能并擴(kuò)展其成像范圍，其中，將cyanine dyes與其他功能性分子進(jìn)行偶聯(lián)（共價綴合），是一種直接而有效的方法。

在各種不同光譜特性的cyanine dyes中，Cy5和Cy7是進(jìn)行共價綴合的優(yōu)先選擇，特別是對于活體成像的應(yīng)用，其具有在NIR“生物窗”波段（＞650nm）進(jìn)行成像的多種優(yōu)勢：深層的組織穿透性，較低的光毒性，可有效減少光散射，具有高信噪比（可最大限度地避免由生物樣本產(chǎn)生的自發(fā)熒光的干擾）。

用于靶向熒光成像的探針

將分析物敏感部位（analyte-sensitive moieties）結(jié)合到cyanine dyes支架中、以此獲得cyanine化學(xué)傳感器，是檢測小分子物質(zhì)的首選工具，包括活性物質(zhì)（活性氧、氮）、生物硫醇（Cys、Hcy、GSH）、無機(jī)親核試劑（N2H4、H2S、CN-）和重金屬離子等。這種探針檢測模式的主要機(jī)制是由分析物引發(fā)的反應(yīng)。
另一方面，許多生物大分子與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后過程密切相關(guān)，因此，對于這些目標(biāo)部位的特異性檢測不僅可以促進(jìn)基礎(chǔ)研究，還具有臨床應(yīng)用價值。cyanine與靶向彈頭的結(jié)合為這些生物大分子的靶向熒光成像提供了強(qiáng)大的可視化工具，其中蛋白質(zhì)構(gòu)成了最大的一群目標(biāo)類型。靶向彈頭的分類見圖2：

圖2：可與cyanine熒光基團(tuán)結(jié)合、用于蛋白質(zhì)和核酸靶向熒光成像的靶向彈頭類型。
蛋白質(zhì)具有相似的靶向策略，其靶向彈頭的范圍從傳統(tǒng)的抗體、小分子和肽到新興的核酸適配體、非免疫球蛋白支架。而在核酸方面，相應(yīng)的靶向彈頭主要包括寡核苷酸及其合成類似物（PNA、肽核酸）等。在此僅對抗體偶聯(lián)探針的情況做詳細(xì)介紹：

cyanine-抗體偶聯(lián)探針

抗體具有針對抗原的特異性和敏感性，是一種代表性的靶向彈頭。由于抗原涵蓋的生物分子范圍廣泛，包括蛋白質(zhì)、肽和多糖，因此cyanine-抗體偶聯(lián)物的適用性非常出色。除全長單克隆抗體 (mAb)外，抗體片段以及雙抗、三抗、微型抗體和納米抗體等也可被用作靶向彈頭。其中，較小的抗體片段具有更深的腫瘤/組織穿透性和更快的血液清除率等優(yōu)點(diǎn)，可以在注射后早期進(jìn)行高對比度成像，并且其免疫原性也更低。
當(dāng)前，癌癥靶向成像是最具應(yīng)用前景的領(lǐng)域，研究人員廣泛研究了可促進(jìn)cyanine偶聯(lián)物在腫瘤中積累的抗原，其中大多數(shù)是在癌細(xì)胞上過度表達(dá)的膜結(jié)合抗原：有些是具有癌癥特異性的，如結(jié)直腸癌和胰腺癌中的癌胚抗原（CEA），乳腺癌和卵巢癌中的人表皮生長因子受體2(HER2)；而其他則是泛腫瘤生物標(biāo)志物，如表皮生長因子受體 (EGFR)。此外，存在于腫瘤微環(huán)境中的抗原也提供了可替代靶點(diǎn)，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。總體而言，cyanine-抗體偶聯(lián)物可作為基于抗體-抗原相互作用原理的多功能診斷和研究工具。
例如：免疫球蛋白上有大量的活性賴氨酸殘基，利用簡便的孵育程序，便可促成cyanine NHS-ester與賴氨酸殘基之間的偶聯(lián)反應(yīng)（圖3a）。

圖3：a）通過賴氨酸殘基方式進(jìn)行連接的cyanine-抗體偶聯(lián)物(1-4)。
偶聯(lián)物1和2分別通過將Cy7 NHS ester與靶向CD20的完全人源化的mAb或與靶向卵巢癌相關(guān)抗原OC183B2的小鼠mAb直接偶聯(lián)而合成；活體近紅外熒光成像（NIRF）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，它們主要在小鼠異種移植模型的腫瘤和肝臟中積累。
采用類似方法，可將A11微型抗體（一種針對PSCA的人源化抗體片段）與IRDye800CW NHS ester進(jìn)行偶聯(lián)，由此產(chǎn)生的偶聯(lián)物3可成功檢測到hPSCA轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的原發(fā)性原位腫瘤和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)。

此外，還可將賴氨酸殘基的氨基轉(zhuǎn)化為另一個反應(yīng)基團(tuán)用于點(diǎn)擊化學(xué)（click chemistry），例如，根據(jù)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所史旭東博士及其同事的報道：利用四嗪NHS ester可得到四嗪修飾的貝伐單抗，通過靜脈注射使其靶向VEGF并得以在體內(nèi)與隨后施用的Reppe酸酐標(biāo)記的Cy5進(jìn)行生物正交綴合。采用該種策略，研究人員可利用偶聯(lián)物4、并借助熒光發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（FLECT/CT）成像技術(shù)，成功地對表達(dá)VEGF的結(jié)腸癌細(xì)胞異種移植物進(jìn)行可視化觀察（圖3b）：

圖3：b）靜脈注射4小時后，在小鼠異種移植模型中捕獲的Reppe酸酐-Cy5的FLECT/CT圖像，其中，預(yù)靶向組使用貝伐單抗-四嗪（偶聯(lián)物4）預(yù)處理24小時，對照組不做預(yù)處理。白色箭頭示腫瘤區(qū)域。

• 多模態(tài)成像探針

光學(xué)成像，放射成像，X射線計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT），磁共振成像（MRI），超聲成像以及核醫(yī)學(xué)成像（NM，如正電子發(fā)射斷層掃描（PET）、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（SPECT））是臨床實(shí)踐中常用的成像模式。多模態(tài)成像，如其名稱所示，是將互補(bǔ)的成像模式進(jìn)行集成，以便通過單次成像最大化地獲取信息，并彌補(bǔ)各單一成像模式所存在的局限。
NIRF成像模式可避免有害的電離輻射，并有利于獲取高靈敏度的實(shí)時圖像。與CT、MRI、PET、SPECT等其他方式相比，單一的NIRF具有空間分辨率低的局限，因此可以通過共價綴合的偶聯(lián)方式獲取多模態(tài)成像造影劑，或針對靶向分子制備多模態(tài)成像探針，以解決應(yīng)用上的挑戰(zhàn)。

以cyanine為基礎(chǔ)的NIRF可與MRI、NM整合為MRI/NIRF、NM/NIRF類型的多模態(tài)成像模式，NM/NIRF還可進(jìn)一步分為PET/NIRF和SPECT/NIRF，如圖4所示：

圖4：與cyanine偶聯(lián)的多模態(tài)成像探針舉例：MRI/NIRF，PET/NIRF和SPECT/NIRF。
技術(shù)聚焦：
基于Cyanine偶聯(lián)策略可進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)影像探針的研發(fā)，包括靶向彈頭和其他可用于靶向熒光成像的造影劑以及多模態(tài)成像探針。在此過程中，一些新穎的技術(shù)手段的運(yùn)用可以幫助研究人員快速獲取更加直觀有效的圖像和結(jié)果，如FLECT/CT技術(shù)（提供深部組織的3D熒光信號細(xì)節(jié)，利于目標(biāo)部位的精準(zhǔn)定位）。我們期待看到cyanine偶聯(lián)物探針作為生物醫(yī)學(xué)影像診斷工具的應(yīng)用潛力得到進(jìn)一步開發(fā)，并促進(jìn)臨床轉(zhuǎn)化方面的進(jìn)展。

期刊名稱：Advanced Healthcare Materials
原文標(biāo)題：Cyanine Conjugate-Based Biomedical Imaging Probes

作者：Yang Li, Yiming Zhou, Xiuli Yue, Zhifei Dai
發(fā)表時間：2020
DOI：10.1002/adhm.202001327

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