活體轉(zhuǎn)染試劑在癌癥啟動子特異性選擇中的應用

哈嘍，艾瑞巴蒂！今天碎碎帶來了活體轉(zhuǎn)染第六彈，給大家淺談一下活體轉(zhuǎn)染試劑在癌癥啟動子特異性選擇中的應用。

本次選取的這篇文章發(fā)表在Cancers，題為-Conversion of a Non-Cancer-Selective Promoter into a Cancer-Selective Promoter。 

此項研究發(fā)現(xiàn)一種特異性調(diào)節(jié)癌細胞中轉(zhuǎn)基因表達的遺傳工具，可以通過在大鼠pGADD(GADD34最小啟動子)中引入特定的點突變將這種非癌癥特異性啟動子轉(zhuǎn)化為癌癥選擇性啟動子, 并且添加GATA2和現(xiàn)有的AP1和PEA3轉(zhuǎn)錄因子將進一步增強了GAPE-Prom的癌癥選擇性活性。GAPE-Prom提供了一種特異性調(diào)節(jié)癌細胞中轉(zhuǎn)基因表達的遺傳工具。

背景:
PEG3是一種廣譜的腫瘤特異性基因,在人癌細胞系中明顯高表達,而在正常組織細胞中極少表達，它的啟動子表現(xiàn)出癌癥選擇性表達，允許轉(zhuǎn)基因的癌癥定向調(diào)節(jié)，病毒復制和動物腫瘤和轉(zhuǎn)移的體內(nèi)成像。而GADD34的過表達抑制生長并誘導細胞凋亡，它的啟動子缺少癌癥特異性。但是PEG-3和GADD34的最小啟動子具有強烈的序列同源性，除了兩個單點突變。本文探索了改變這兩種核苷酸在決定癌癥選擇性基因表達中的相關(guān)性。

接著我們具體看看文章中活體轉(zhuǎn)染的應用思路吧

首先為了確定為什么pPEG（PEG34最小啟動子）與pGADD的功能差異，比較了二者序列，發(fā)現(xiàn)兩個不同的堿基對，后對pGADD進行定點突變，轉(zhuǎn)化為pPEG，稱pGAPE。后將啟動子克隆到載體上后轉(zhuǎn)化進人的癌細胞，原代細胞，以及正常的永生細胞中，進行熒光素酶檢測。
結(jié)果表明pGAPE與pPEG在癌細胞中表現(xiàn)出類似的高表達。而在上的所有細胞系中， pGADD活性沒有顯著變化(Fig 1)。

Fig.1 在癌細胞中pGAPE展現(xiàn)出與pPEG類似的高表達

接著，作者驗證了腫瘤動物體內(nèi)pPEG和pGAPE啟動子的癌癥特異性。使用in vivo jetPEI 進進行不同啟動子的傳遞和成像。在這里，作者選取雄性無胸腺裸鼠，進行全身給藥。40 μg DNA 和 4.8 μL in vivo jetPEI 分別稀釋在不含內(nèi)毒素的 5% (wt/vol) 葡萄糖中，混合，配置成400ul注射液。單次 200 μL 注射液以 5分鐘的間隔靜脈注射兩次。注射后48h進行活體成像觀察。這里，作者特意選取in vivo jetPEI而非病毒遞送，來避免有偏好的全身遞送。


結(jié)果表明，在所有的模型中，當由pPEG或pGAPE驅(qū)動時，可以通過BLI特異性地在腫瘤中檢測到熒光素酶，而由pGADD驅(qū)動的熒光素酶活性對腫瘤不具有特異性。

最后，作者總結(jié)兩點突變對于將非癌癥特異性pGADD轉(zhuǎn)化為癌癥選擇性pGAPE至關(guān)重要，這種新設(shè)計的pGAPE體現(xiàn)了所有必要的功能，使其成為以癌癥選擇性方式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達的理想工具，既可以無創(chuàng)地提供成像劑以跟蹤腫瘤促進和轉(zhuǎn)移，又可以創(chuàng)建表達癌癥中獨特復制功能的CRAD。