基因編輯調(diào)控技術(shù)之細(xì)胞轉(zhuǎn)染的分類、途徑、實(shí)驗(yàn)流程及影響因素

轉(zhuǎn)染——是將外源基因如DNA、RNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。是真核細(xì)胞在一定條件下主動(dòng)或被動(dòng)導(dǎo)入外源基因而獲得新的表型的過(guò)程。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、基因表達(dá)調(diào)控、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等領(lǐng)域中，轉(zhuǎn)染技術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。
 

圖1 轉(zhuǎn)染

 

轉(zhuǎn)染的分類

根據(jù)外源性基因在真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)間的長(zhǎng)短我們可將轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(永久轉(zhuǎn)染)兩種。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，外源基因得以表達(dá)但它們并不會(huì)整合到細(xì)胞的基因組中，也就不會(huì)被復(fù)制，適用的核酸類型主要包括質(zhì)粒DNA、siRNA、miRNA和mRNA。細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的外源基因表達(dá)時(shí)間有限，通常僅持續(xù)幾天，直到外源基因在細(xì)胞分裂過(guò)程中因各種因素丟失為止。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是建立在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上的，先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，再對(duì)得到的細(xì)胞進(jìn)行篩選，在少數(shù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，外源基因能夠整合到細(xì)胞的基因組中。適用的核酸類型只有質(zhì)粒DNA，且外源基因成為細(xì)胞基因組的一部分從而得以復(fù)制，這就是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的標(biāo)志。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的子代細(xì)胞也同樣表達(dá)外源基因，由此形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。
 

圖2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的區(qū)別
 

常規(guī)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的途徑

1．化學(xué)介導(dǎo)法

主要是使用載體分子去中和或者使帶負(fù)電的核酸帶正電荷，讓核酸更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。主要包括DEAE-葡聚糖法、磷酸鈣法、陽(yáng)離子脂質(zhì)體法、陽(yáng)離子聚合物法等。

化學(xué)介導(dǎo)法	原理	主要應(yīng)用	特點(diǎn)
DEAE-葡聚糖法	帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞	瞬時(shí)轉(zhuǎn)染	相對(duì)簡(jiǎn)便、重復(fù)比磷酸鈣好，但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用，轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清且一般只用于BSC-1、CV-1、COS細(xì)胞系
磷酸鈣法	磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞	穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染	不適用于原代細(xì)胞(所需的DNA濃度較高)，操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差，有些細(xì)胞不適用。細(xì)胞建議用CSCL梯度離心，轉(zhuǎn)染時(shí)拷貝數(shù)較多
人工脂質(zhì)體法	帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物，然后脂質(zhì)體上剩余的電核與細(xì)胞膜上的唾液酸殘基的負(fù)電核結(jié)合	穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染	使用方法簡(jiǎn)單，可攜帶大片段DNA，通用于各種類型的裸露DNA或RNA，能轉(zhuǎn)染各種類型的細(xì)胞，沒有免疫原性。雖在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率，但在體內(nèi)，能被血清清除，并在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致高水平的毒性，這在很大程度上限制了其應(yīng)用
陽(yáng)離子聚合物	帶正電的聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成帶正電的復(fù)合物后與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，并通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞	穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染所有細(xì)胞	除了具有陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率高、操作簡(jiǎn)單、適用范圍廣、重復(fù)性好等特點(diǎn)外，還具有在體內(nèi)、轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低等特點(diǎn)，是新一代的轉(zhuǎn)染方法

 

2．物理介導(dǎo)法

物理介導(dǎo)法是將核酸直接遞送到細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。主要包括電轉(zhuǎn)染、顯微注射法、基因槍法。

物理介導(dǎo)法	原理	主要應(yīng)用	特點(diǎn)
電轉(zhuǎn)染	通過(guò)高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電，DNA通過(guò)膜上形成的小孔導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)	穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染所有細(xì)胞	適用性廣，除了質(zhì)粒外還可轉(zhuǎn)染大的基因組(>65kb)，但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大， 需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件，拷貝數(shù)較少只有1-20
顯微注射法	用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核	穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染	轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限，多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎細(xì)胞
基因槍法	將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放、表達(dá)	穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染	可用于的細(xì)胞類型有：人的表皮細(xì)胞，纖維原細(xì)胞，淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞

 

3．生物介導(dǎo)法

又稱之為病毒介導(dǎo)法，是利用包裝了外源基因的病毒感染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。病毒介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染效率很高，尤其是針對(duì)難轉(zhuǎn)染的活體細(xì)胞、原代細(xì)胞。主要包括慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等病毒介導(dǎo)法。

生物介導(dǎo)法	病毒基因	原理	主要應(yīng)用	特點(diǎn)
慢病毒	RNA病毒	包裝系統(tǒng)由包裝成分和載體成分組成。將包裝成分與載體成分的多個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，即可在細(xì)胞上清中收獲攜帶目的基因的復(fù)制的慢病毒載體顆粒。包裝好的病毒顆�？梢灾苯佑糜谒拗骷�(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子	穩(wěn)定轉(zhuǎn)染特定宿主細(xì)胞	可以感染分裂期和非分裂期細(xì)胞、容納外源性基因片段大，可以長(zhǎng)期表達(dá)等顯著優(yōu)點(diǎn)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒	RNA病毒	通過(guò)病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用而進(jìn)入宿主細(xì)胞，之后反轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)合成DNA并隨機(jī)整合到宿主基因組中	穩(wěn)定轉(zhuǎn)染特定宿主細(xì)胞	可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等，但攜帶基因不能太大(<8kb)，細(xì)胞需處分裂期，需考慮安全因素
腺病毒	雙鏈DNA病毒	先和細(xì)胞表面的受體結(jié)合，繼而被細(xì)胞內(nèi)吞	瞬時(shí)轉(zhuǎn)染特定宿主細(xì)胞	可用于感染分裂期和非分裂期細(xì)胞、難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，需考慮安全因素

圖3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染的途徑
 

細(xì)胞轉(zhuǎn)染相關(guān)實(shí)驗(yàn)

圖4 細(xì)
胞轉(zhuǎn)染流程圖

以質(zhì)粒DNA為例介紹細(xì)胞轉(zhuǎn)染的流程(24孔板、貼壁細(xì)胞、核酸轉(zhuǎn)染試劑盒(貨號(hào)：abs60259))：
 

實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器設(shè)備

CO₂培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、水浴鍋、醫(yī)用冰箱、-80℃冰箱、移液器(一套)、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀等。
 

1.2試劑耗材
DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、磷酸緩沖溶液(PBS)、胰酶、核酸轉(zhuǎn)染試劑盒(abs60259)、24孔板、1.5ml無(wú)菌離心管若干等。
 

實(shí)驗(yàn)步驟

Step1 細(xì)胞接種:

1．轉(zhuǎn)染前一天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)接，每孔接種1.5-2.0×10⁵個(gè)細(xì)胞，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度為90%左右，且生長(zhǎng)良好(非常重要)；

2．最好在轉(zhuǎn)染開始之前更換新鮮的含血清培養(yǎng)基，以防轉(zhuǎn)染后孵育階段細(xì)胞密度太大、營(yíng)養(yǎng)不足導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
 

Step2 試劑A/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備(該步完成后應(yīng)立即進(jìn)行轉(zhuǎn)染):

1．在1.5 ml無(wú)菌離心管A中加入50µl無(wú)血清培養(yǎng)基，再加入適量的轉(zhuǎn)染試劑A，見下表8。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。

2．在1.5 ml無(wú)菌離心管B中加入50µl無(wú)血清培養(yǎng)基，并加入適量的試劑B，輕輕混勻，再加入適量的DNA，見下表8。用移液器再次輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。

3．將DNA-培養(yǎng)基混合物滴加至試劑A-培養(yǎng)基混合物中，用移液器輕輕混勻后在室溫靜置15~20分鐘后，立即轉(zhuǎn)染。

注意： 1. 試劑A-培養(yǎng)基混合物和DNA-培養(yǎng)基混合物的混合次序非常重要，切勿顛倒。

  2. 離心管最好使用聚丙烯離心管。
 

Step3 轉(zhuǎn)染:

1．將Step2制備的轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加至培養(yǎng)基中，邊加邊輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板以使復(fù)合物均勻分布。加完后，立即將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

2．培養(yǎng)12小時(shí)后即可觀察，最佳觀察或收獲時(shí)間為24~48小時(shí)。

3．試劑A在完全培養(yǎng)基中仍有較高的轉(zhuǎn)染效率，因此轉(zhuǎn)染前后不需要換成無(wú)血清或低血清培養(yǎng)基。

培養(yǎng)皿		96孔板	48孔板	24孔板	12孔板	6孔板	10cm皿
培養(yǎng)基、試劑、DNA量	無(wú)血清培養(yǎng)基(μl)	2x10	2x25	2x50	2x100	2x200	2x1000
	試劑A(μl)	0.5	1.3	2.5	5	10	50
	試劑B(μl)	0.4	1	2	4	8	40
	1ug/ul plasmid(μl)	0.16	0.4	0.8	1.6	3.2	16
完全培養(yǎng)基		0.1	0.25	0.5	1	2	10

表5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不同培養(yǎng)體系推薦初始轉(zhuǎn)染條件
 

影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果的因素
(1) 細(xì)胞密度

細(xì)胞密度對(duì)轉(zhuǎn)染效率有一定的影響。不同的轉(zhuǎn)染試劑，要求轉(zhuǎn)染時(shí)的最適細(xì)胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會(huì)因不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。轉(zhuǎn)染時(shí)過(guò)高或者過(guò)低的細(xì)胞密度會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低，乃至表達(dá)水平偏低。因此如果選用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑，最好能夠進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)并為以后的實(shí)驗(yàn)建立一個(gè)穩(wěn)定方法，包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時(shí)間等。陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑具有微量的細(xì)胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細(xì)胞數(shù)，有的要求細(xì)胞達(dá)到90%匯合度；而研究細(xì)胞周期等表達(dá)周期長(zhǎng)的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進(jìn)行轉(zhuǎn)染的試劑。一般轉(zhuǎn)染時(shí)貼壁細(xì)胞密度大致為50%-90%，但這個(gè)需要參考所選轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書。
 

(2) 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

這點(diǎn)非常關(guān)鍵，很多時(shí)候傳代次數(shù)太少或者太多都將導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染試劑敏感度的改變。因此，為了提高轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性、降低細(xì)胞毒性，應(yīng)盡量使用適度傳代、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞系。最適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過(guò)幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,最容易轉(zhuǎn)染。
 

(3) 細(xì)胞種類、轉(zhuǎn)染試劑、轉(zhuǎn)染方法

不同細(xì)胞種類的細(xì)胞在做轉(zhuǎn)染時(shí)轉(zhuǎn)染效率通常不同，因此所需要的轉(zhuǎn)染體系是不同的，不能一種轉(zhuǎn)染體系用在所有類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。每種轉(zhuǎn)染試劑都有不同的轉(zhuǎn)染方法，但大都大同小異，同時(shí)目前產(chǎn)品都會(huì)提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn)，通過(guò)這些資料可選擇最適合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)染試劑。另外，在大規(guī)模使用前，仍需進(jìn)行轉(zhuǎn)染試劑和核酸最優(yōu)比例的實(shí)踐摸索。
 

(4) 核酸類型及質(zhì)量

用于轉(zhuǎn)染的核酸類型一般有質(zhì)粒DNA、mRNA 、sirNA和miRNA，針對(duì)不同的核酸一般采用不同的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染方法。另外在制備高純度DNA時(shí)，還需要對(duì)DNA進(jìn)行內(nèi)毒素的去除，內(nèi)毒素的存在會(huì)造成細(xì)胞毒性，嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)DNA質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染的效果影響也非常大，一般轉(zhuǎn)染技術(shù)是基于電荷吸引原理，如果DNA不純，帶有污染物都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的的形成。

圖6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染圖