項(xiàng)目文章 ：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序刻畫腭中縫膜內(nèi)成骨模型

 
2022年11月，北京大學(xué)口腔醫(yī)院國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心聯(lián)合首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院在學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表題為“Midpalatal Suture: Single-Cell RNA-Seq Reveals Intramembrane Ossification and Piezo2 Chondrogenic Mesenchymal Cell Involvement”的研究成果。文章首次使用單細(xì)胞測(cè)序深入研究了腭中縫區(qū)域，有助于建立腭中縫膜內(nèi)成骨模型，并揭示了Piezo2⁺成軟骨向間充質(zhì)細(xì)胞在骨成熟和重塑過(guò)程中的潛在分子特征。
新格元在該研究中承擔(dān)了組織保存與解離、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組(GEXSCOPE^®)測(cè)序以及單細(xì)胞數(shù)據(jù)生信分析等工作。
下面和元小新一起來(lái)看一下單細(xì)胞如何揭示腭中縫膜內(nèi)成骨模型吧。
 
研究背景
腭中縫是上頜骨寬度生長(zhǎng)發(fā)育的主要部位，也是對(duì)上頜寬度發(fā)育不足者進(jìn)行上頜快速擴(kuò)弓(RME)過(guò)程中阻抗的主要來(lái)源部位。探索腭中縫成熟骨化過(guò)程，闡明其中的潛在機(jī)制，有助于確定腭中縫RME的最佳時(shí)機(jī)與矯形力大小，臨床意義重大。然而，與腭中縫相關(guān)的機(jī)制研究很少，目前腭中縫成熟骨化過(guò)程未見(jiàn)單細(xì)胞測(cè)序相關(guān)研究。

 
思維導(dǎo)圖  

研究結(jié)果
1.小鼠模型腭中縫的組織學(xué)染色和Micro-CT分析
隨著周齡的增長(zhǎng)，腭中縫的彎曲程度增加，4、5周齡時(shí)腭中縫形態(tài)較直，9周齡時(shí)較為彎曲。此外，從4周齡至9周齡，腭中縫寬度減小，骨密度(BMD)、骨體積/組織體積(BV/TV)明顯增加。Micro-CT結(jié)果提示，隨著腭中縫成熟骨化，其形態(tài)更加交錯(cuò)、寬度更窄，骨化程度增加，但需要注意的是，腭中縫在9周齡時(shí)仍未融合。組織學(xué)染色觀察驗(yàn)證了Micro-CT分析結(jié)果，腭中縫區(qū)主要由纖維細(xì)胞、纖維和成骨細(xì)胞組成，在4周齡時(shí)觀察到軟骨細(xì)胞，但在5和9周齡時(shí)很少見(jiàn)。   2.小鼠模型腭中縫的單細(xì)胞RNA測(cè)序分析
利用單細(xì)胞RNA測(cè)序分析腭中縫區(qū)域的細(xì)胞和分子組成，質(zhì)量控制后獲得45,677個(gè)細(xì)胞，包括來(lái)自4周齡小鼠的16,686個(gè)細(xì)胞、來(lái)自5周齡小鼠的17,053個(gè)細(xì)胞、以及來(lái)自9周齡小鼠的11,938個(gè)細(xì)胞。確定了5種主要的細(xì)胞類型，包括上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、以及神經(jīng)細(xì)胞(圖2A)。
由于間充質(zhì)細(xì)胞在成熟骨化過(guò)程中，特別是在骨基質(zhì)形成中作用至關(guān)重要，因此，從整體細(xì)胞群中選擇間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分析。結(jié)果表明間充質(zhì)細(xì)胞由5個(gè)不同的簇組成，包括周細(xì)胞(標(biāo)志基因?yàn)?em>Acta2、Rgs5、Nes)、成骨向間充質(zhì)細(xì)胞(標(biāo)志基因?yàn)?em>Ibsp、Mmp13、Bglap2)、成軟骨向間充質(zhì)細(xì)胞(標(biāo)志基因?yàn)?em>Col2a1、Col9a1、Col9a2、Ucma)、成纖維向間充質(zhì)細(xì)胞(標(biāo)志基因?yàn)?em>Smoc2、Col8a1、Dpep1)、以及神經(jīng)樣細(xì)胞(標(biāo)志基因?yàn)?em>Olig2、Rtn1、Elavl4)(圖2B)。
擬時(shí)序與RNA速率分析顯示了各簇間充質(zhì)細(xì)胞的分化軌跡，并進(jìn)一步表明9簇間充質(zhì)細(xì)胞處于不同的狀態(tài)。在擬時(shí)序分析中，周細(xì)胞位于上支，成骨向間充質(zhì)細(xì)胞-1(Ost.b1)位于兩個(gè)下支，成骨向間充質(zhì)細(xì)胞-2 (Ost.b2)和成骨向間充質(zhì)細(xì)胞-3(Ost.b3)位于右下支，成纖維向間充質(zhì)細(xì)胞-1、2、3(Fib.1、Fib.2、Fib.3)位于左下支(圖2C)。RNA速率分析表明，雖然3個(gè)成骨向間充質(zhì)細(xì)胞簇起始情況不同，但它們向相同的終點(diǎn)分化(圖2D)。
    3.不同成骨向間充質(zhì)細(xì)胞簇在腭中縫膜內(nèi)成骨中的作用
為了描述腭中縫的成骨過(guò)程，對(duì)成骨向間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了差異表達(dá)基因(DEGs)和通路分析。Ost.b1的上調(diào)通路與間充質(zhì)發(fā)育和血管生成相關(guān)，Ost.b2的上調(diào)通路與生物礦化和細(xì)胞外基質(zhì)組織相關(guān)，Ost.b3的上調(diào)通路與組織重塑、軟骨發(fā)育和破骨細(xì)胞分化相關(guān)(圖3A、B)。4周齡的成骨向間充質(zhì)細(xì)胞(Ost.b-4w)的上調(diào)通路與細(xì)胞增殖相關(guān)，Ost.b-5w的上調(diào)通路與破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化相關(guān)，Ost.b-9w的上調(diào)通路與軟骨內(nèi)骨形態(tài)發(fā)生相關(guān)(圖3C、D)。
進(jìn)一步分析三個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)各細(xì)胞亞簇內(nèi)成骨向間充質(zhì)細(xì)胞的軌跡。結(jié)果表明，Ost.b1主要位于左側(cè)支，Ost.b2主要位于右側(cè)支，Ost.b3分布于左、右分支，這提示每個(gè)成骨向間充質(zhì)細(xì)胞亞簇處于不同狀態(tài)(圖3E)。RNA速率分析驗(yàn)證了上述結(jié)果(圖3F)。 4.Piezo2⁺成軟骨向間充質(zhì)細(xì)胞的鑒定
由于軟骨細(xì)胞在膜內(nèi)成骨中可能發(fā)揮重要作用，因此，研究者進(jìn)一步分析了腭中縫區(qū)成軟骨向間充質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量、百分比與通路富集狀態(tài)(圖4A、B)。這些細(xì)胞中上調(diào)的通路與軟骨凝集、結(jié)締組織發(fā)育和機(jī)械刺激感受有關(guān)。對(duì)成軟骨向間充質(zhì)細(xì)胞與其他間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行差異基因分析，發(fā)現(xiàn)了Piezo2基因的差異表達(dá)，這是一個(gè)與機(jī)械感覺(jué)離子通道相關(guān)的經(jīng)典標(biāo)記基因(圖4C)。Piezo2基因的pct.1(0.35)與pct.2(0.037)差異較大，表明Piezo2是成軟骨向間充質(zhì)細(xì)胞的特異性基因(圖4D)。
  5.Piezo2⁺成軟骨向間充質(zhì)細(xì)胞可能與感受機(jī)械刺激與傷口愈合有關(guān)
接下來(lái)，研究者進(jìn)行DEGs與通路富集分析，以明確Piezo2⁺和Piezo2^-成軟骨向間充質(zhì)細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄差異(圖5A、B)。與Piezo2^-相比，Piezo2⁺成軟骨向間充質(zhì)細(xì)胞的機(jī)械刺激相關(guān)基因(Junb、Fos、lers)表達(dá)量更高，并且似乎與傷口愈合、對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的反應(yīng)、間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化等相關(guān)(圖5C、D)。對(duì)Piezo2進(jìn)行免疫組化染色，驗(yàn)證了Piezo2⁺成軟骨向間充質(zhì)細(xì)胞的存在，佐證了上述結(jié)果(圖5E)。    
結(jié)論
為了探索腭中縫成熟骨化過(guò)程的潛在機(jī)制，本研究建立了一種小鼠腭中縫模型，結(jié)合經(jīng)典的組織學(xué)染色分析、Micro-CT分析、以及前沿的單細(xì)胞測(cè)序分析，明確了腭中縫的細(xì)胞與分子組成。本研究首次使用單細(xì)胞RNA測(cè)序?qū)﹄裰锌p中的細(xì)胞群和成骨過(guò)程進(jìn)行了表征，并發(fā)現(xiàn)了Piezo2⁺成軟骨向間充質(zhì)細(xì)胞群，提示間充質(zhì)細(xì)胞有潛力參與腭中縫的成熟骨化過(guò)程。成骨向間充質(zhì)細(xì)胞分為3個(gè)簇(Ost.b1、Ost.b2、Ost.b3)，在膜內(nèi)成骨過(guò)程中發(fā)揮多種作用。間充質(zhì)細(xì)胞增殖、聚集(Ost.b1)、并分化為成骨細(xì)胞(Ost.b1、Ost.b2、Ost.b3)；成骨細(xì)胞形成骨化中心，分泌類骨質(zhì)，誘導(dǎo)骨礦化(Ost.b2)，并轉(zhuǎn)化為骨細(xì)胞；骨重建貫穿整個(gè)過(guò)程(Ost.b3)(圖6)。此外，Piezo2⁺成軟骨向間充質(zhì)細(xì)胞可能與感受機(jī)械刺激有關(guān)，并有潛力在腭中縫成骨過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用�？傊�，本文對(duì)腭中縫成熟骨化過(guò)程的研究具有創(chuàng)新性的重要意義。
   
參考文獻(xiàn)
Lu Gao, Tiansong Xu , Liqi Zhang，et al. Midpalatal Suture: Single-Cell RNA-Seq Reveals Intramembrane Ossification and Piezo2 Chondrogenic Mesenchymal Cell Involvement.2022 Nov 12;11(22):3585.