瓊脂糖凝膠電泳的原理、操作流程及方法

原理
 

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是:它兼有"分子篩"和"電泳"的雙重作用。
 

瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過(guò)時(shí)會(huì)受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相比于蛋白質(zhì)太大，對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。
 

蛋白質(zhì)和核酸會(huì)根據(jù)pH不同帶有不同電荷，在電場(chǎng)中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據(jù)這個(gè)原理可將其分開(kāi)。電泳緩沖液的pH在6~9之間，離子強(qiáng)度0.02~0.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達(dá)10^7bp的DNA片段。
 

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動(dòng)。

操作流程

準(zhǔn)備干凈的配膠板和電泳槽

注意DNA酶污染的儀器可能會(huì)降解DNA，造成條帶信號(hào)弱、模糊甚至缺失的現(xiàn)象。

電泳方法

一般的核酸檢測(cè)只需要瓊脂糖凝膠電泳就可以;如果需要分辨率高的電泳，特別是只有幾個(gè)bp的差別應(yīng)該選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳;用普通電泳不合適的巨大DNA鏈應(yīng)該使用脈沖凝膠電泳。注意巨大的DNA鏈用普通電泳可能跑不出膠孔導(dǎo)致缺帶。

凝膠濃度

對(duì)于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.5~2%之間，低濃度的用來(lái)進(jìn)行大片段核酸的電泳，高濃度的用來(lái)進(jìn)行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現(xiàn)象。

緩沖液

常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時(shí)使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。

電壓和溫度

電泳時(shí)電場(chǎng)強(qiáng)度不應(yīng)該超過(guò)20V/cm，電泳溫度應(yīng)該低于30℃，對(duì)于巨大的DNA電泳，溫度應(yīng)該低于15℃。注意如果電泳時(shí)電壓和溫度過(guò)高，可能導(dǎo)致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太大可能導(dǎo)致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象

DNA樣品的純度和狀態(tài)

注意樣品中含鹽量太高和含雜質(zhì)蛋白均可以產(chǎn)生條帶模糊和條帶缺失的現(xiàn)象。乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的DNA樣品可能導(dǎo)致條帶模糊和缺失，也可能出現(xiàn)不規(guī)則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對(duì)DNA樣品加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。

DNA的上樣

正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的DNA上樣量可能導(dǎo)致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導(dǎo)致帶信號(hào)弱甚至缺失。

Marker的選擇

DNA電泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正對(duì)照DNA來(lái)估計(jì)DNA片段大小。Marker應(yīng)該選擇在目標(biāo)片段大小附近ladder較密的，這樣對(duì)目標(biāo)片段大小的估計(jì)才比較準(zhǔn)確。需要注意的是Marker的電泳同樣也要符合DNA電泳的操作標(biāo)準(zhǔn)。如果選擇λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要預(yù)先65℃加熱5min，冰上冷卻后使用。從而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接頭導(dǎo)致的片段連接不規(guī)則或條帶信號(hào)弱等現(xiàn)象。

凝膠的染色和觀察

實(shí)驗(yàn)室常用的核酸染色劑是溴化乙錠(EB)，染色效果好，操作方便，但是穩(wěn)定性差，具有毒性。注意觀察凝膠時(shí)應(yīng)根據(jù)染料不同使用合適的光源和激發(fā)波長(zhǎng)，如果激發(fā)波長(zhǎng)不對(duì)，條帶則不易觀察，出現(xiàn)條帶模糊的現(xiàn)象。

回收

DNA片段的膠回收方法

電泳洗脫法

低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳挖塊法

凍融回收法

玻璃奶回收法

柱回收法

膠回收注意事項(xiàng)

將電泳槽用ddH2O反復(fù)清洗干凈，倒入新鮮配制的滅菌電泳緩沖液;

根據(jù)點(diǎn)樣量制備合適厚度的瓊脂糖凝膠板;

切膠時(shí)盡可能切掉不含DNA片段的凝膠;

要盡量減少DNA在紫外下的照射時(shí)間以減少對(duì)DNA的損傷;

熔膠要完全。

切膠時(shí)還要注意手臂不要有裸露皮膚，以防被紫外線直接照射，如果有條件的話還可以戴一副防護(hù)眼鏡，減少對(duì)眼睛的傷害。