MicroFab的應(yīng)用：對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞按需噴墨實(shí)現(xiàn)細(xì)胞級(jí)精度生物打印

浦項(xiàng)科技大學(xué)相關(guān)研究人員通過MicroFab的Jetlab®Ⅱ噴墨打印系統(tǒng)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行了按需噴墨（DOD）的微陣列打印，并采用MicroFab的30μm、50μm和80μm噴頭搭建了微液滴發(fā)生裝置，進(jìn)行了對(duì)噴射的哺乳動(dòng)物細(xì)胞液滴的觀測(cè)和研究。噴墨打印后的細(xì)胞存活率與未打印的對(duì)照組一致。

介紹

活細(xì)胞和生物材料的直接打印，也稱為“生物打印”，為組織工程和再生醫(yī)學(xué)打開了新的大門，代表了傳統(tǒng)的基于預(yù)成型支架的組織工程的突破。鑒于生物打印能夠?qū)⒓?xì)胞和生物材料放置在具有適當(dāng)細(xì)胞組成和密度的預(yù)定位置，2D細(xì)胞圖案或3D結(jié)構(gòu)的制造取得了巨大進(jìn)展，例如皮膚、耳朵、軟骨等。除了簡(jiǎn)單或薄的結(jié)構(gòu)之外，還出現(xiàn)了對(duì)通過準(zhǔn)確和精確的細(xì)胞打印來模擬天然復(fù)雜和厚的器官在天然組織長(zhǎng)度尺度（10μm~100μm）上具有異質(zhì)性的正常功能但高度復(fù)雜、分層和分層結(jié)構(gòu)的需求。復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)也需要細(xì)胞級(jí)精度。這些活組織和器官在組織學(xué)上是涉及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的多細(xì)胞構(gòu)建體，它們各自的功能可以通過微環(huán)境表達(dá)，微環(huán)境對(duì)3D空間中這些組件之間的相互作用很敏感。因此，穩(wěn)定可靠地控制3D空間中細(xì)胞和生物材料的空間位置和排列對(duì)于高分辨率至關(guān)重要，該分辨率幾乎等于生物結(jié)構(gòu)和功能組織的微觀組織結(jié)構(gòu)。

為確保生物打印能夠形成精心設(shè)計(jì)的架構(gòu)，已推出各種類型的打印機(jī)，例如按需噴墨（DOD）、微擠壓、激光輔助和電流體動(dòng)力（EHD）等。在這些生物打印技術(shù)中，DOD噴墨打印已被證明是一種有前途的方法，可根據(jù)需要精確沉積受控體積的載有細(xì)胞的液滴。鑒于需要精確微小液滴沉積的空間濃度梯度在生物技術(shù)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，例如在工程微環(huán)境中，已通過使用30μm噴頭打印生長(zhǎng)因子的空間濃度梯度來探索固定生長(zhǎng)因子上的細(xì)胞行為。在合成細(xì)菌細(xì)胞間多細(xì)胞相互作用的研究中，也已使用21.5μm噴頭打印約2μm長(zhǎng)的熒光蛋白和大腸桿菌的濃度梯度。此外，單個(gè)細(xì)胞的隨機(jī)或自動(dòng)噴射可以在具有所需細(xì)胞密度的3D空間中引發(fā)帶狀組織。

然而，高分辨率或微小液滴體積的名聲已被普遍采用的大直徑噴頭所削弱，為了實(shí)現(xiàn)直徑范圍為15~20μm的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的高分辨率打印，具體情況見表一

^a細(xì)胞活力通過對(duì)照正�；�或與對(duì)照進(jìn)行比較。

在這項(xiàng)工作中，研究團(tuán)隊(duì)使用了一個(gè)MicroFab的30μm噴頭打印NIH/3T3和HEK293A細(xì)胞，目的是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞級(jí)精度，并研究打印過程。在評(píng)估了NIH/3T3細(xì)胞生物墨水的流體特性（例如剪切粘度和動(dòng)態(tài)表面張力）后，研究人員使用高速成像技術(shù)分析了噴頭內(nèi)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和射流形成。使用用于形成無衛(wèi)星單滴的優(yōu)化打印條件，將一系列細(xì)胞打印到玻璃基板上，以計(jì)算打印的皮升液滴輸送的細(xì)胞數(shù)量。此外，系統(tǒng)地研究了細(xì)胞濃度、不同大小的細(xì)胞類型和噴頭直徑對(duì)細(xì)胞數(shù)分布的影響。最后，用live/dead和CCK-8測(cè)定以及顯微鏡觀察檢查了印后細(xì)胞活力、增殖和形態(tài)學(xué)細(xì)胞特征。
 

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

用于高速可視化皮升液滴的自制噴墨打印設(shè)備，如下圖所示。

▲ 細(xì)胞打印和單閃頻閃成像裝置示意圖。生物墨水通過噴頭直徑為30μm的MicroFab壓電噴頭噴射。

MicroFab的壓電打印噴頭能產(chǎn)生滿足要求的皮升級(jí)微液滴。采用噴頭孔徑分別為30μm、50μm和80μm。從數(shù)據(jù)采集板的模擬輸出端口生成兩個(gè)模擬波形。驅(qū)動(dòng)波形由MicroFab的CT-M3-04電壓脈沖控制器生成。驅(qū)動(dòng)波形用的脈沖持續(xù)時(shí)間和電壓控制幅度分別為40μs~61μs和30V~68V。放大后，脈沖被施加到噴頭中的壓電換能器以噴射液滴。另一個(gè)模擬脈沖被發(fā)送到一個(gè)高分辨率、每像素0.74μm的CCD相機(jī)和一個(gè)持續(xù)時(shí)間非常短的納米閃光燈（150ns）通過用于單次閃光高速攝影的數(shù)字延遲。圖像以每秒5-10幀（fps）的速率獲取。還通過使用商用高速相機(jī)成像以100000fps的記錄速率和光纖耦合鹵素?zé)臬@得了連續(xù)高速圖像。發(fā)射頻率設(shè)置為50Hz~200Hz。

使用Jetlab®Ⅱ噴墨打印系統(tǒng)來計(jì)算每個(gè)打印液滴中的細(xì)胞數(shù)。分別用30μm、50μm和80μm口徑的噴頭打印20×20的點(diǎn)陣列。再用30μm口徑的噴頭打印360×360的點(diǎn)陣列，用于驗(yàn)證此噴墨技術(shù)的穩(wěn)定性。所有實(shí)驗(yàn)均在1000級(jí)潔凈室進(jìn)行，以確保環(huán)境無塵無菌。

▲ MicroFab高精度納米材料沉積噴墨打印系統(tǒng)Jetlab®Ⅱ

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

噴頭內(nèi)的細(xì)胞軌跡

將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到玻璃毛細(xì)管噴頭后，在噴射過程中跟蹤它們?cè)趪婎^內(nèi)的運(yùn)動(dòng)。下圖顯示了用高速相機(jī)記錄下的細(xì)胞向下移動(dòng)到噴頭口的運(yùn)動(dòng)過程。噴射頻率設(shè)置為5Hz，通過使用短持續(xù)時(shí)間頻閃和高分辨率CCD相機(jī)獲取高質(zhì)量圖像。

在不同噴射時(shí)間拍攝的高速圖像顯示，細(xì)胞在向下移向噴頭孔徑時(shí)加速，由于風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng)或伯努利原理，噴頭孔徑逐漸縮小。上圖a顯示，沿中心的細(xì)胞（黃色虛線圓圈）比靠近壁的細(xì)胞（紅色虛線圓圈）更快地移動(dòng)到孔徑。上圖b顯示，細(xì)胞的移動(dòng)速度的差異是由噴頭中的速度分布引起的，由于壁處沒有滑動(dòng)條件，它被推測(cè)為拋物線分布。

此外，細(xì)胞遷移是由脈沖壓力和重力驅(qū)動(dòng)的。細(xì)胞運(yùn)動(dòng)不是連續(xù)的，但是當(dāng)壓電致動(dòng)器產(chǎn)生脈沖壓力以產(chǎn)生液滴時(shí)，細(xì)胞會(huì)進(jìn)行去停運(yùn)動(dòng)。當(dāng)噴頭啟動(dòng)并分配約10pL的液滴體積時(shí)，生物墨水重新填充到孔口，細(xì)胞立即移動(dòng)。一滴噴射后，隨著彎液面振蕩衰減，細(xì)胞略有波動(dòng)。對(duì)于頻閃的一個(gè)間隔步驟，單元的平均速度和瞬時(shí)速度預(yù)期分別為Vcell,avg=Δl/Δtinterval∼10μm/0.1s=100μm/s和Vcell,max=Δl/Δtpulse∼10μm/10μs=1m/s。相反，雖然儲(chǔ)層中的細(xì)胞在恒定重力的影響下緩慢沉降，但事實(shí)證明，重力對(duì)噴頭中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響可以忽略不計(jì)�；�于將細(xì)胞視為剛性球體的假設(shè)，根據(jù)斯托克斯定律，單元的自由沉降速度（Vg）的值為

其中g(shù)、ρc、ρb、a和μb分別是重力加速度、細(xì)胞和生物墨水的密度、細(xì)胞半徑和生物墨水在低剪切速率下的動(dòng)態(tài)粘度。該Vg被預(yù)測(cè)為2.5μm每秒，這意味著重力不占主導(dǎo)地位，并且細(xì)胞的移動(dòng)行為與噴射體積密切相關(guān)。

單滴形成

下圖顯示了單次閃光圖像，顯示在低電壓驅(qū)動(dòng)下細(xì)胞懸浮液?jiǎn)蔚涡纬傻难葑�。在脈沖持續(xù)期間，噴頭開始出現(xiàn)噴射頭，在施加波形后，噴射韌帶變窄，直至最終解體。斷裂后，短韌帶縮回頭部，最終形成穩(wěn)定的球狀水滴并擺動(dòng)。下圖b表明穩(wěn)定打印保持在約1.3×105滴。通過使用X-Y移動(dòng)臺(tái)，將單個(gè)液滴圖案化到玻璃基板上，液滴間距為120μm。

單滴形成對(duì)于確保穩(wěn)定和可重復(fù)的細(xì)胞打印至關(guān)重要。通常，細(xì)胞以不規(guī)則的方式影響射流的形態(tài)。特別是在長(zhǎng)韌帶的情況下，噴射韌帶（包括細(xì)胞）的形態(tài)是異常的，因?yàn)榕c變薄的韌帶相比，細(xì)胞的直徑更大。但是，如果細(xì)胞位于主頭部，則形態(tài)穩(wěn)定且規(guī)則，與沒有細(xì)胞的射流形態(tài)無法區(qū)分。射流形態(tài)和打印性能（例如，液滴直徑和速度）可以通過輸入波形的形狀進(jìn)行調(diào)制。

通過之前的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。最終結(jié)果表明，與常用的較大噴頭直徑相比，30μm的小噴頭直徑可以實(shí)現(xiàn)更高百分比的單細(xì)胞打印。

細(xì)胞活力和增殖

使用live/dead測(cè)定法測(cè)定打印后立即存活率、CCK-8測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)率和Hoechst 33342染色測(cè)定細(xì)胞形態(tài)，研究通過小噴頭噴射對(duì)細(xì)胞活力和增殖的影響。首先，下圖a通過基于live/dead檢測(cè)試劑盒自動(dòng)分析綠色和紅色染色的細(xì)胞群來顯示細(xì)胞活力。

作為對(duì)照，移液到孔中的細(xì)胞的存活率為96.2%，從30μm和80μm噴頭噴射的細(xì)胞的存活率分別為94.4%和96.3%。這種高存活率與先前關(guān)于使用較大噴頭尺寸的基于噴墨的細(xì)胞打印的研究報(bào)告的結(jié)果一致。接下來，進(jìn)行CCK-8測(cè)定以研究在達(dá)到平臺(tái)期之前的7天小噴頭直徑是否影響細(xì)胞的體外增殖。盡管由于最初接種的細(xì)胞數(shù)（數(shù)據(jù)未顯示），每組之間的細(xì)胞數(shù)有所不同，但這些細(xì)胞培養(yǎng)組顯示出與上圖b中代表細(xì)胞生長(zhǎng)速率的曲線斜率相同的細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)�；�于采用自然生長(zhǎng)規(guī)律的簡(jiǎn)單細(xì)胞群模型，表示為

P(t) = P0ekt, 

其中t、P0和k分別代表培養(yǎng)時(shí)間（天）、初始種群和（人均）增長(zhǎng)率；每個(gè)組中的細(xì)胞在第1天以與每個(gè)初始群體相似的增長(zhǎng)率呈指數(shù)增長(zhǎng)。最后，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查以進(jìn)行定性分析。如上圖c所示，未觀察到明顯的形態(tài)異常和DNA斷裂；此外，這些打印的細(xì)胞仍然保持良好的對(duì)基材的粘附能力。這些結(jié)果表明，30μm噴墨噴頭對(duì)打印的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的影響和損害可以忽略不計(jì)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

研究團(tuán)隊(duì)展示了基于DOD噴墨的細(xì)胞打印，30μm噴頭可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞級(jí)精度。高速成像技術(shù)表明，噴頭內(nèi)的細(xì)胞在壓電致動(dòng)器產(chǎn)生的脈沖壓力下在噴頭內(nèi)進(jìn)行往復(fù)運(yùn)動(dòng)。在評(píng)估了載有細(xì)胞的生物墨水的流體特性后，優(yōu)化了打印條件以生成沒有衛(wèi)星的載有細(xì)胞的單滴。結(jié)果表明，液滴中的細(xì)胞數(shù)量受噴頭尺寸（ 30、50和80μm）和細(xì)胞濃度（2.5×106個(gè)細(xì)胞/ml和5.0×106個(gè)細(xì)胞/ml）的影響很大，而打印不同的細(xì)胞類型在數(shù)量上幾乎沒有變化。30μm噴墨噴頭能夠在5.0×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度下平均每滴打印1.3個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。更大的噴頭允許更多的細(xì)胞通過。分別使用live/dead檢測(cè)試劑盒、CCK-8檢測(cè)和細(xì)胞形態(tài)成像檢測(cè)細(xì)胞的活力、增殖和形態(tài)。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)用非常小的噴頭打印后的細(xì)胞存活率與未打印的對(duì)照一致。噴墨打印非常適合活細(xì)胞的沉積，因?yàn)樗鼘�為精確沉積皮升體積的載有細(xì)胞的液滴而設(shè)計(jì)。此外，使用一個(gè)30μm噴頭可以幫助最大化噴墨技術(shù)，以細(xì)胞級(jí)精度精確沉積生物墨水。

資料來源：[1] Kim Y K ,  Park J A ,  Yoon W H , et al. Drop-on-demand inkjet-based cell printing with 30-μm nozzle diameter for cell-level accuracy[J]. Biomicrofluidics, 2016, 10(6):064110.