免疫共沉淀Co-IP實驗流程及文獻中的結(jié)果解讀
What is Co-IP？
Co-IP全稱Co-Immunoprecipitation，中文學名免疫共沉淀，是一種以抗體和抗原識別專一性為基礎，用于研究蛋白質(zhì)之間相互作用的經(jīng)典方法。
通俗點來說，假設我們需要研究樣品中A蛋白和B蛋白之間是否存在一些相互作用，首先我們通過合適的方法處理樣本，將蛋白提取出來（同時不能破壞蛋白之間的相互作用），然后用預先結(jié)合了瓊脂糖珠或者磁珠的A蛋白抗體捕獲樣本中的A蛋白，那么與A蛋白結(jié)合的B蛋白也能一起沉淀下來。再將蛋白從珠子上裂解下來，對B蛋白進行檢測，能檢測到，說明B蛋白在之前的沉淀過程中隨著A蛋白一起被拉下來了，進而證明二者之間存在相互關系。
How to do？
各名稱解析：
IB：全稱immunoblotting，即免疫印跡，也就是常規(guī)的Western Blotting，用于顯示目的蛋白。
IP：全稱immunoprecipitation，即免疫沉淀，這一步主要是為了純化富集目的蛋白。
Input：全細胞裂解液，含有細胞內(nèi)所有的蛋白，可認為是陽性組。也就是處理完樣本得到的細胞裂解液，在做IP實驗之前，需要先跑WB，確認樣本中含有蛋白A和蛋白B。
Anti-A：A蛋白的免疫共沉淀抗體
IgG：Anti-A的同型對照抗體，即跟Anti-A同來源同種型，如Anti-A是兔來源IgG型，則同型對照抗體需要選擇Rabbit IgG
結(jié)果圖解析：
該結(jié)果是為驗證蛋白A與蛋白B是否存在相互作用。本實驗一共分為兩大組：Input組及IP組，其中IP組又分為IgG組（陰性對照組）和實驗組，并通過WB去驗證蛋白A和B在每一個組里面是否存在。由Input組的條帶可以得到結(jié)論：蛋白A與蛋白B都是存在的，證明樣本處理提取蛋白的步驟沒有任何問題。陰性對照IgG組和實驗組平行進行免疫沉淀實驗，結(jié)果蛋白A與蛋白B均沒有條帶，說明利用IgG抗體沒有把蛋白A和B沉淀下來，證明蛋白A和B與IgG沒有結(jié)合，排除了蛋白與抗體非特異性結(jié)合的可能性；而實驗組蛋白A和B均有條帶，表示利用蛋白A的抗體進行沉淀實驗，成功把蛋白A沉淀下來了，與此同時蛋白B也被沉淀下來，進而得到結(jié)論：蛋白A與蛋白B之間存在相互作用。
確切來說，試劑盒的50T代表著能夠完成50次免疫沉淀反應，而實際上免疫共沉淀實驗需要設置多個組別進行對照驗證，因此具體能夠完成多少次Co-IP實驗由設計方案決定，一般至少需要設置陰性對照、陽性對照、實驗組三個組別。
這個步驟的目的是為去除樣本中可與protein A/G瓊脂糖珠非特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，減少干擾，非必做，如CoIP實驗中發(fā)現(xiàn)有較多雜帶，可考慮做一下；但應注意，選擇此步驟后，需要消耗瓊脂糖珠，后續(xù)能夠進行免疫沉淀的次數(shù)也相應減少。
首先需要排除lgG和后續(xù)WB一抗同源導致的輕重鏈的干擾條帶（25kd和50kd附近）；再者建議進行預清除實驗以排除Protein A/G的非特異性結(jié)合；再就是考慮lgG的問題可以換用其他品牌lgG嘗試。
※ 出現(xiàn)假陽性結(jié)果該怎么排除？
假陽性結(jié)果需要設置對應的陰性對照組一一排除，假設實驗組為瓊脂糖珠+抗體X+靶蛋白X+抗體Y+目的蛋白Y：
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可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果的成因 |
對照組設置 |
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瓊脂糖珠與X蛋白發(fā)生非特異結(jié)合 |
瓊脂糖珠+抗體X+抗體Y |
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瓊脂糖珠與Y蛋白發(fā)生非特異結(jié)合 |
瓊脂糖珠+蛋白Y |
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抗體X和目的蛋白Y非特異性結(jié)合 |
瓊脂糖珠+抗體X+蛋白Y |
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抗體的非特異性結(jié)合 |
IgG+蛋白X+蛋白Y |
※ 最后的實驗結(jié)果是陰性的，是否能說明兩個蛋白之間無相互作用？
對于內(nèi)源性Co-IP實驗，陰性結(jié)果不能百分百說明無相互作用，也有可能是蛋白在細胞內(nèi)表達過低導致，因此建議先做過表達Co-IP作為對照。
