紅外檢測在硝酸纖維素基片蛋白質(zhì)微陣列掃描中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)微陣列，也稱為蛋白質(zhì)芯片，是小型化的平行實驗系統(tǒng)，包含少量純化蛋白質(zhì)或肽的高密度陣列。蛋白質(zhì)微陣列應(yīng)用包含蛋白質(zhì)分析到發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA 或蛋白質(zhì)-藥物相互作用。蛋白質(zhì)微陣列實驗原理與DNA 微陣列相同：將純化的蛋白質(zhì)、肽或細胞提取物固定在基片表面，通常是經(jīng)過表面修飾的載玻片，從而制成蛋白質(zhì)微陣列。同時，細胞提取物、血清、組織提取物或純化抗體等樣品用熒光分子標記。然后標記的樣品和微陣列上固定 的蛋白質(zhì)雜交。如果標記樣品中存在微陣列蛋白質(zhì)的目標結(jié)合分子，則會在微陣列上檢測到熒光信號（圖 1）。 使用蛋白質(zhì)微陣列，研究人員可以在單個實驗中評估數(shù)百或數(shù)千種蛋白質(zhì)的表達或活性。這就是為什么蛋白質(zhì)微陣列在基礎(chǔ)和臨床研究中的應(yīng)用非常廣。目前可以使用市場上現(xiàn) 有的蛋白質(zhì)微陣列進行蛋白質(zhì)組分析。

根據(jù)載玻片固定的蛋白質(zhì)類型及其應(yīng)用，蛋白質(zhì)微陣列分為三類：分析性蛋白質(zhì)微陣列、 功能性蛋白質(zhì)微陣列和反相蛋白質(zhì)微陣列 RPPA。

分析性蛋白質(zhì)微陣列通常是通過在載玻片上點印抗體、純化的蛋白質(zhì)，序列明確的肽或非折疊抗原構(gòu)建的，然后用蛋白質(zhì)溶液進行雜交。該技術(shù)基于夾心 ELISA 方法，用于測量溶液或樣品中的蛋白表達水平。分析性蛋白質(zhì)微陣列主要用于建立復雜樣品的蛋白質(zhì)表達譜。通過這種方式，研究人員可以在蛋白水平上描述細胞對不同刺激如環(huán)境壓力、疾病、感染或炎癥的反應(yīng)。

功能性蛋白質(zhì)微陣列由全長功能性蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域組成，這些蛋白或結(jié)構(gòu)域連接到通常由多孔結(jié)構(gòu)聚合物修飾的功能化基片上。 它們用于研究蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)、大分子或小分子的相互作用，例如配體-受體相互作用，以及用于測試蛋白活性，例如激酶微 陣列等。利用功能性蛋白質(zhì)微陣列，可以研究蛋白質(zhì)相互作用，例如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)- DNA、蛋白質(zhì)-RNA、蛋白質(zhì)-磷脂和蛋白質(zhì)-小分子相互作用。因此，功能性蛋白質(zhì)陣列在基礎(chǔ)研究中非常有用，可以在單個實驗中研究幾種蛋白質(zhì)的生化活性。
 

圖 1. 蛋白質(zhì)陣列工作流程分析

反相蛋白質(zhì)微陣列 (RPPA) 類似微型化斑點印跡。在 RPPA 中，使用蛋白芯片點樣儀將細胞裂解物或血漿等樣品點印到載玻片上，通過使用針對目標蛋白的標記抗體對樣品微陣列進行檢測。RPPA 是一種有用的工具，單個實驗可評估數(shù)百個不同樣本中的蛋白表達水平。RPPA 微陣列是轉(zhuǎn)化醫(yī)學和臨床研究的潛在工具，因為它們可用于疾病生物標志物的驗證和疾病分型。例如，通過監(jiān)測生物標志物對于不同疾病階段不同藥物劑量的動態(tài)響應(yīng)，研究人員可以關(guān)聯(lián)每個疾病階段的藥物效率，然后為每個疾病階段確定最佳療法，這是個性化醫(yī)療的主要目標之一。

如上所述，蛋白質(zhì)陣列的應(yīng)用范圍非常廣泛。 表 1 總結(jié)了其中的一些。
 

表 1：蛋白質(zhì)微陣列眾多應(yīng)用中的一些示例

 

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)研究方法一次只能研究一種或幾種蛋白質(zhì)。耗時耗錢的檢測不適用于系統(tǒng)生物學和個性化醫(yī)學�；�于二維電泳結(jié)合質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學費時費力。此外，作為該方法的一部分；蛋白質(zhì)必須變性，這不利于蛋白質(zhì)活性測試。蛋白質(zhì)微陣列作為有前景的工具出現(xiàn)，通過將完整的蛋白質(zhì)固定排列到適當化學修飾的載玻片上來闡明功能蛋白質(zhì)組。蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)的主要挑戰(zhàn)之一是在固定來自復雜樣品蛋白質(zhì)的同時維持蛋白質(zhì)活性完整。現(xiàn)在通過修改微陣列基片表面化學性質(zhì)，可為蛋白質(zhì)相互作用測定保留蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性。表面化學方法的進步促進了符合蛋白質(zhì)穩(wěn)定性要求的三維修飾基片發(fā)展。

當用經(jīng)典微陣列掃描儀波長讀取信號時，其中一些基片會發(fā)出強烈的背景熒光信號。廣泛用于構(gòu)建蛋白質(zhì)微陣列的硝酸纖維素涂層載玻片尤其如此。硝酸纖維素產(chǎn)生的強背景熒導致低信噪比和低靈敏度。使用近紅外 (NIR) 檢測可以顯著減少由硝化纖維素和其他基片產(chǎn)生的背景熒光問題。樣品用近紅外熒光團標記，來提高目標分子檢測信噪比并提高蛋白質(zhì)相互作用的檢測靈敏度。掃描儀的選擇取決于用于標記的熒光分 子。并非所有蛋白質(zhì)微陣列實驗都在近紅外波長上讀取信號。表 2 列出了不同型號掃描儀兼容的熒光分子。
 

表 2. 與 InnoScan 710 和 710IR 微陣列掃描儀兼容的熒光染料示例

蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)的進步促進了蛋白質(zhì)產(chǎn)品市場的快速發(fā)展。蛋白質(zhì)微陣列在疾病生物標志物發(fā)現(xiàn)和驗證的應(yīng)用，反映了蛋白質(zhì)微陣列在個性化醫(yī)療領(lǐng)域的巨大潛力，與新蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)的發(fā)展相協(xié)調(diào)， Innoscan 710 和 710IR 掃描儀可提供此類檢測所需的高分辨率和靈敏度。將 InnoScan 710IR 與適當?shù)募t外熒光染料結(jié)合使用，可以避免硝酸纖維素等基片的背景熒光，從而提高靈敏度，而靈敏度是蛋白質(zhì)微陣列檢測的主要挑戰(zhàn)之一。
 

InnoScan 710 掃描儀 用于檢測經(jīng)典的532nm 和 635nm激發(fā)波長的熒光分子
InnoScan 710IR 用于檢測 670nm 和 785nm 激發(fā) 波長的紅外熒光分子

Innopsys 成立于1999年�？偛课挥诜▏�。分部設(shè)立于美國的芝加哥。一直致力于生物醫(yī)學領(lǐng)域相關(guān)儀器和軟件的自主研發(fā)和生產(chǎn)。Innoscan系列掃描儀，采用先進的多共聚焦掃PMT檢測器和多激光掃描光路，可以同時進行多通道檢測。不僅有效降低了熒光光漂白現(xiàn)象以及信號損失，還可以有效的縮短掃描時間。掃描過程中，可實時自動聚焦。根據(jù)芯片片基高度變化，自動調(diào)節(jié)焦距以獲得最佳掃描結(jié)果。Innoscan系列不僅是擁有快速、高分辨率和靈活等特點的掃描儀產(chǎn)品系列，更是基因、蛋白、糖類、細胞、組織等多種芯片研究的強大工具。在基因組和蛋白組表達，基因突變，SNP檢測，CGH，細菌病毒檢測，腫瘤特異性標志篩查，病理組織篩查等方面都有非常廣泛的應(yīng)用。 

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