ELISA酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定的分類和實(shí)驗(yàn)流程

定義：

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（簡(jiǎn)寫ELISA）指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法。
常用的ELISA可以分為五大類：直接ELISA、間接ELISA、夾心ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA。其他的ELISA都由這五類組合衍生。
所有的ELISA基本由基礎(chǔ)的幾個(gè)步驟組合而成：將抗原或抗體吸附到固相載體上；加入待檢樣品以及后續(xù)試劑；溫育；洗滌去掉游離未結(jié)合的反應(yīng)物；加入酶檢測(cè)底物；結(jié)果的判讀

分類：

1.直接ELISA

將抗原按一定的比例稀釋，包被到固相載體上，加入稀釋好的特異性的酶標(biāo)抗體，孵育后加入底物顯色并判讀結(jié)果。直接ELISA中只經(jīng)過了一步信號(hào)放大，所以其靈敏度不是很高

2.間接ELISA

間接ELISA與直接ELISA不同的是，與包被好的抗原結(jié)合的是非酶標(biāo)抗體，另外再引入第二種抗體（即二抗）。二抗是經(jīng)過酶標(biāo)的，它可以與第一種抗體特異性結(jié)合，最后加入底物顯色并判讀結(jié)果。在檢測(cè)抗體的效價(jià)、血清的效價(jià)以及單克隆抗體的篩選過程中，間接ELISA都是非常重要的實(shí)驗(yàn)過程。

3.夾心ELISA

3.1直接夾心ELISA

3.1.1雙抗體夾心ELISA           

將第一種抗體（捕獲抗體）包被在固相載體上，封閉后加入待檢抗原，溫育后加入第二種抗體（檢測(cè)抗體），捕獲抗體和檢測(cè)抗體可以是針對(duì)不同表位的兩種單抗，也可以是針對(duì)同一抗原的一種單抗與一種多抗，但是檢測(cè)抗體需要經(jīng)過酶標(biāo)。

3.1.2雙抗原夾心ELISA

原理和操作與雙抗體夾心ELISA基本相同，不同的是包被的是抗原，待檢對(duì)象是抗體，然后加入酶標(biāo)抗原，再加底物顯色。雙抗原夾心ELISA利用特異性的抗原代替酶標(biāo)二抗，所以特異性比間接法更好。另外，由于間接ELISA中使用的二抗一般只能識(shí)別IgG，而雙抗原夾心ELISA中任何類似的免疫球蛋白都可以被檢測(cè)出，因此，雙抗原夾心ELISA比間接ELISA也更靈敏。

3.2間接夾心ELISA

間接夾心ELISA是基于兩種不同種屬來源的抗體的夾心ELISA，其原理是將一種種屬來源的特異性抗體包被于固相載體上（作為捕獲抗體），封閉，加入待檢抗原，溫育，洗滌后加入另一種種屬來源的特異性抗體（非酶標(biāo)，作為檢測(cè)抗體），最后加入酶標(biāo)二抗（特異性識(shí)別檢測(cè)抗體），再加底物顯色。與直接雙抗夾心ELISA相比，其中引入了特異性識(shí)別檢測(cè)抗體的酶標(biāo)二抗，相當(dāng)于整個(gè)體系的信號(hào)增加了一步放大系統(tǒng)，最終的結(jié)果比直接雙抗夾心ELISA更靈敏。

4.競(jìng)爭(zhēng)ELISA

將特異性抗體吸附于固相載體表面，經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和被測(cè)抗原的混合液；而另一組只加酶標(biāo)記抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測(cè)定的未知抗原的量。這種方法所測(cè)定的抗原只要有一個(gè)結(jié)合部位即可，因此，對(duì)小分子抗原如激素和藥物之類的測(cè)定常用此法。

5.競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA

預(yù)先將抗原包被在固相載體上，實(shí)驗(yàn)時(shí)加入稀釋好的待檢抗原（或抗體），然后依次加入特異性的抗體以及此抗體對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)二抗。待檢標(biāo)本中的抗原（或抗體）就和預(yù)制備體系中固相載體上結(jié)合的抗原（或抗體）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性的抗體（或固相載體上結(jié)合的抗原）。洗掉被競(jìng)爭(zhēng)的特異性抗體，最后加底物顯色。最終顯色的結(jié)果與待檢抗原（或抗體）量呈反比。

實(shí)驗(yàn)材料：

96孔高吸附酶標(biāo)板[NEST]            10μL/200μL/1000μL吸頭[NEST]
單通道移液槍、多通道移液槍        微量離心管[NEST]
顯色液（A/B液）                  15/50ml離心管[NEST]
洗液（PBST）                      終止液（H2SO4）
BSA蛋白                           稀釋液（PBS）
包被液（CB）                      全波段酶標(biāo)儀
恒溫箱

實(shí)驗(yàn)流程：

以使用比較廣泛的間接ELISA為例，簡(jiǎn)述實(shí)驗(yàn)過程

1.抗原包被：

將對(duì)應(yīng)抗原用CB稀釋至1ug/ml，加入96孔酶標(biāo)板孔中，每孔100ul，4℃包被過夜，之后進(jìn)行下一步驟。若實(shí)驗(yàn)時(shí)間比較緊張，包被后可放置恒溫箱內(nèi)，37℃包被3h后即可進(jìn)行下一步操作。

2.洗板：

將酶標(biāo)板內(nèi)的包被液甩干，用洗液（PBST——0.2%的吐溫20 PBS）清洗酶標(biāo)板2次，并拍干板內(nèi)液體，使之無余液殘留。

3.封閉：

用PBS充分溶解BSA蛋白制備成封閉液（體積比為5~10%），將封閉液加入酶標(biāo)板孔中，每孔150ul，恒溫箱37℃封閉1h。若實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排充裕，可在4℃條件下封閉過夜。

【若抗原內(nèi)含有偶聯(lián)BSA分子，則更換封閉成分，可用羊血清代替】

4.洗板：

將酶標(biāo)板內(nèi)的封閉液液甩干，用洗液（PBST）清洗酶標(biāo)板2次，并拍干板內(nèi)液體，使之無余液殘留。

【若暫無使用需求，可將包被后的酶標(biāo)板放置-20℃條件下儲(chǔ)存，需要時(shí)解凍使用即可�！�

5.一抗：

用PBS稀釋液將待檢樣品（含有對(duì)應(yīng)抗原的抗體）按需求稀釋，再將稀釋后樣本加入包被好的酶標(biāo)板中，每孔100ul，陰性對(duì)照孔加入100ulPBS稀釋液，在恒溫箱中37℃孵育1h。

6.洗板：

將酶標(biāo)板內(nèi)的一抗甩干，用洗液（PBST）清洗酶標(biāo)板3次，并拍干板內(nèi)液體，使之無余液殘留。

7.二抗：

用PBS稀釋液按照說明，稀釋對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)二抗，將稀釋完成的二抗加入一抗孵育完成的酶標(biāo)板中，每孔100ul，恒溫箱37℃孵育30min。

8.洗板：

將酶標(biāo)板內(nèi)的二抗甩干，用洗液（PBST）清洗酶標(biāo)板4次，并拍干板內(nèi)液體，使之無余液殘留。

9.顯色：

將顯色液A/B液等體積混合，配置成顯色液，加入二抗孵育完成的酶標(biāo)板中，每孔100ul，恒溫箱避光37℃反應(yīng)5~10min。

【顯色液現(xiàn)配現(xiàn)用，不可提前配置】

10.終止與讀數(shù)：

顯色完成后，無須丟棄顯色液，直接加入終止液（H2SO4）終止反應(yīng)，每孔50ul，隨即轉(zhuǎn)移至全波段酶標(biāo)儀450nm單波長(zhǎng)度數(shù)，或450nm/620nm雙波長(zhǎng)讀數(shù)，讀書完成后處理數(shù)據(jù)。

使用到的NEST產(chǎn)品：

96孔高吸附酶標(biāo)板[NEST]            10μL/200μL/1000μL吸頭[NEST]

微量離心管[NEST]                  15/50ml離心管[NEST]