mRNA技術(shù)在傳染病疫苗研發(fā)中的應用及進展
早在30多年前，科學家們就構(gòu)思出基于 mRNA 的核酸疫苗，能夠開發(fā)出安全和多功能的核酸疫苗。如今隨著mRNA技術(shù)的不斷發(fā)展，這一愿望終于照進現(xiàn)實，新冠mRNA疫苗率先開發(fā)成功并投入生產(chǎn)，推動了mRNA疫苗在他傳染病領(lǐng)域、癌癥、罕見病等領(lǐng)域的研發(fā)進展。
2021年8月25日，Nature Reviews Drug Discovery發(fā)表了一篇深度綜述，詳細介紹了mRNA疫苗的技術(shù)基礎(chǔ)，以及傳染病mRNA疫苗開發(fā)的最近進展和關(guān)鍵問題。
圖1
在這篇綜述中，作者描述了 mRNA 疫苗的技術(shù)基礎(chǔ)，包括 mRNA 設(shè)計和合成，以及遞送技術(shù)并強調(diào)了正在進行的平臺優(yōu)化工作的主要焦點。之后概述了針對流感、寨卡病毒和呼吸道合胞病毒 (RSV) 等多種傳染病的 mRNA 疫苗的開發(fā)進展，并討論了該平臺未來面臨的關(guān)鍵問題，包括安全性、反應持續(xù)時間、在特定人群中的應用和實現(xiàn)全球疫苗可及性。
mRNA疫苗的主要包含人工合成的mRNA分子，它們指導抗原的產(chǎn)生，從而激發(fā)免疫反應。mRNA的結(jié)構(gòu)主要包括5個部分，從5’端開始，分別是5’cap，5’非轉(zhuǎn)錄區(qū)（UTR），編碼抗原的開放閱讀框，3’UTR和poly A尾巴。每個部分對于mRNA疫苗的正常工作都至關(guān)重要。
5’端帽的作用之一是防止mRNA被細胞中識別病毒RNA的傳感器發(fā)現(xiàn)，從而預防意外的免疫反應。它還在空間上保護mRNA免受核酸外切酶的降解。3’ poly A尾的長度間接調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)譯和半衰期。5’和3’UTR調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)譯、半衰期和細胞內(nèi)定位。對UTR的工程化設(shè)計可以改變mRNA的細胞定位，或者降低mRNA的降解。
圖2 mRNA結(jié)構(gòu)的5個部分[1]
編碼抗原的開放閱讀框是最重要的一部分。這一部分的改良包括對mRNA密碼子的優(yōu)化，將不常用的密碼子轉(zhuǎn)換為編碼同一氨基酸的常用密碼子可以提高轉(zhuǎn)譯水平。例如，CureVac公司的新冠疫苗CVnCoV就使用了密碼子優(yōu)化。
提高翻譯效率的另一個措施是引入修飾核苷，例如假尿嘧啶，N1-甲基假尿嘧啶等核苷。使用修飾過的核苷能夠防止模式識別受體的識別，降低免疫原性，增加翻譯。Moderna和輝瑞/BioNTech的mRNA新冠疫苗都使用了修飾過的核苷。
除了改進 mRNA 序列外，在簡化 mRNA 生產(chǎn)方面也取得了重大進展。目前臨床使用的合成mRNA使用噬菌體 RNA 聚合酶 T7從質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)錄而成。mRNA的poly A尾序列已經(jīng)編碼到質(zhì)粒DNA中，從而減少了反應步驟，在降低生產(chǎn)時間的同時減少了材料損失。將poly A尾序列加入到質(zhì)粒DNA中同時解決了poly A尾合成長度不一的問題。通常，poly A尾長度超過100個堿基對于治療性mRNA效果最佳，然而過長的多腺嘌呤序列會破壞用于轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒DNA�？朔摲�(wěn)定性問題的解決方案是在poly A尾中添加UGC序列接頭。輝瑞/BioNTech的新冠疫苗BNT162b2就使用了這種接頭。
總之，這些創(chuàng)新克服了生產(chǎn)瓶頸，并促進了一種簡單、經(jīng)濟高效和可擴展的一步 mRNA 合成工藝的開發(fā)。
因為mRNA是一個包含負電荷的大分子，它無法穿過由陰離子脂質(zhì)雙層構(gòu)成的細胞膜，此外在體內(nèi)，它會被先天免疫系統(tǒng)的細胞吞噬并被核酸酶降解，因此它的體內(nèi)應用需要使用遞送載體。目前的遞送載體包括以下幾種類型：
一、脂質(zhì)納米顆粒
脂質(zhì)納米顆粒（LNP）是目前臨床上最先進的mRNA遞送技術(shù)，目前所有獲得授權(quán)使用的新冠mRNA疫苗均采用LNP作為載體。LNP具有多種優(yōu)勢，包括易于配制、具有模塊性、生物相容性和mRNA載荷水平高。
LNP通常包含四種成分，可電離脂質(zhì)（ionizable lipid）、膽固醇、輔助磷脂和PEG化脂質(zhì)分子。它們結(jié)共同封裝保護脆弱的mRNA分子。
圖3 脂質(zhì)納米顆粒的主要脂質(zhì)成分[1]
可電離脂質(zhì)分子可以說是LNP中最重要的成分，它們在酸性環(huán)境下攜帶正電荷，讓它們可以與攜帶負電荷的mRNA結(jié)合生成LNP。在生理pH值時它們呈中性，這提高了它們的安全性，并且延長了它們在血液循環(huán)中的駐留時間。在被細胞吞噬進入內(nèi)體后，內(nèi)體的酸性環(huán)境會讓它們重新攜帶正電荷，從而促進與內(nèi)體細胞膜的融合，將mRNA釋放到細胞質(zhì)中。
膽固醇通過填充脂質(zhì)之間的間隙來提高納米顆粒的穩(wěn)定性，并且?guī)椭|(zhì)體與內(nèi)體細胞膜的融合。
輔助脂質(zhì)分子調(diào)節(jié)納米顆粒的流動性，并且輔助與內(nèi)體的細胞膜融合。
PEG化脂質(zhì)可穩(wěn)定LNP，通過限制脂質(zhì)融合調(diào)節(jié)納米顆粒的大小，并通過降低與巨噬細胞的非特異性相互作用來提高納米顆粒的半衰期。
二、復合物和聚合物納米粒子
盡管在臨床進展不如LNP迅速，但是聚合物與脂質(zhì)具有類似的優(yōu)勢，并能有效遞送mRNA。陽離子聚合物可以與mRNA形成不同大小的復合體。目前已經(jīng)有多種可以被生物降解的聚合物材料用于有效遞送mRNA，如聚乙烯亞胺、聚β-氨基酯、聚酰胺基胺。
圖4 遞送mRNA的聚合物納米顆粒[1]
三、其它遞送系統(tǒng)
除了基于脂質(zhì)和聚合物的載體外，多肽也可以被用于遞送mRNA，主要歸功與其主鏈和側(cè)鏈中的陽離子或雙親性胺基團，可以與mRNA結(jié)合。
最后，基于角鯊烯（squalene）的陽離子納米乳液也被用于遞送mRNA。這些納米乳液由一個基于角鯊烯的核心和一個脂質(zhì)外殼構(gòu)成。mRNA被吸附在納米乳液的表面。有些角鯊烯的配方可以起到佐劑的作用。例如諾華的MF59在FDA批準的流感疫苗中作為佐劑。MF59導致注射部位的細胞分泌趨化因子，募集抗原呈遞細胞，誘導單核細胞分化為樹突狀細胞，并增強抗原呈遞細胞對抗原的攝取。
圖5 遞送mRNA的陽離子納米乳液[1]
在mRNA技術(shù)的臨床應用方面，針對傳染病的疫苗開發(fā)是進展最快的方向。綜述指出，截至2021年6月18日，目前進入臨床開發(fā)階段的102種新冠疫苗中，有19款為mRNA疫苗。在新冠病毒之外，多款mRNA疫苗也已經(jīng)進入臨床開發(fā)階段，用于預防流感病毒、巨細胞病毒（CMV）、寨卡病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、狂犬病毒等病原體的感染。針對不同的病原體，mRNA疫苗的開發(fā)也會遇到不同的挑戰(zhàn)。包括病毒突變迅速（HIV病毒），高致死性（狂犬病毒），新病毒株和突變體的產(chǎn)生（流感病毒和新冠病毒）等等。因此mRNA疫苗的設(shè)計也需要做出相應的調(diào)整，包括靶向抗原中保守的區(qū)域，攜帶多種突變體或者病毒株的抗原等等。
圖6 針對不同病原體開發(fā)mRNA疫苗面對的挑戰(zhàn)和應對策略[1]
一、抗體反應的持久性
有些mRNA遞送系統(tǒng)主動靶向抗原呈遞細胞，讓它們成為生產(chǎn)抗原的“細胞工廠”。通過在LNP表面偶聯(lián)單克隆抗體或者與樹突狀細胞特異性結(jié)合的配體，在主動遞送mRNA進入抗原呈遞細胞方面已經(jīng)獲得可喜的效果。此外，通過延長抗原性 mRNA 的翻譯來改變疫苗的藥代動力學已成為增強抗體反應的令人興奮的工具。
二、針對新興病毒變體的疫苗開發(fā)
病毒基因組在復制時常常會發(fā)生突變。雖然大部分突變對病毒的功能沒有影響，但是有些突變可能增強免疫逃逸，限制疫苗的效力。目前，針對病毒突變的創(chuàng)新策略包括開發(fā)靶向病毒保守區(qū)域的疫苗；或者讓疫苗編碼廣譜中和抗體。
三、安全性
總體來說，mRNA疫苗的安全性特征良好，在臨床試驗中只發(fā)現(xiàn)輕度或中度不良事件。綜述指出，疫苗造成的過敏反應在接種輝瑞/BioNTech新冠疫苗人群中出現(xiàn)的比例大約為每百萬次接種中出現(xiàn)4.7例，Moderna疫苗這一數(shù)值為2.5例/百萬次接種。這個數(shù)值是更為傳統(tǒng)的疫苗的2-4倍。一種假設(shè)是過敏反應歸因于LNP中使用的PEG化脂質(zhì)分子。由于人們此前使用過很多包含PEG的日用產(chǎn)品（例如牙膏、洗發(fā)露等等），身體中已經(jīng)存在針對PEG的抗體。這些抗體可能提高過敏反應出現(xiàn)的可能性，并且限制疫苗的效力。因此，mRNA疫苗開發(fā)領(lǐng)域需要對疫苗配方導致過敏反應的機制有更深入的了解，從而改進配方，提高安全性特征。
四、特定人群的疫苗接種
孕產(chǎn)婦、兒童、老年人等特定人群由于其免疫系統(tǒng)的不同，一些病毒對其會產(chǎn)生更嚴重的影響，而mRNA疫苗在該類人群中的使用也需要進一步的縱向評估。
五、疫苗的可及性
疫苗的可及性是達到廣泛保護目的面對的最大挑戰(zhàn)，特別是在低收入國家。對于已經(jīng)獲得授權(quán)的mRNA新冠疫苗來說，可及性進一步受到冷藏條件的限制。如果要在全球范圍內(nèi)對幾十億人進行接種，則需要耐熱性更好的疫苗。
六、展望未來
mRNA 設(shè)計和核酸遞送技術(shù)數(shù)十年的進步，以及新抗原靶點的發(fā)現(xiàn)，使 mRNA 疫苗成為對抗新興流行病和現(xiàn)有傳染病的非凡工具。相信隨著科學的進步和技術(shù)的發(fā)展，mRNA技術(shù)能夠獲得更為廣泛的應用，造福廣大病患！
參考文獻
【1】Chaudhary N, Weissman D, Whitehead KA. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat Rev Drug Discov. 2021 Nov;20(11):817-838.
