酶消化法和熱修復(fù)法兩種抗原修復(fù)方法的優(yōu)缺點(diǎn)對比
在樣本制備的過程中，往往會應(yīng)用一些試劑（如多聚甲醛、福爾馬林等）對新鮮組織進(jìn)行處理，這個(gè)過程可能導(dǎo)致抗原位點(diǎn)被封閉，為了避免影響后續(xù)免疫染色的效果，我們需要先對切片進(jìn)行抗原修復(fù)。對于石蠟切片來說，抗原修復(fù)是不可或缺的步驟，常用的方法有酶消化法和熱修復(fù)法。
作為最早的抗原修復(fù)方法，常用的消化酶有三：胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K。但酶的作用極易受溫度影響，如果消化不足，則無法充分暴露出抗原位點(diǎn)，過度的消化又會破壞組織結(jié)構(gòu)，影響最后陽性信號的判讀，因此在后續(xù)的發(fā)展中，酶消化法漸漸被熱修復(fù)技術(shù)所替代，但對于個(gè)別抗原，如免疫球蛋白、補(bǔ)體，以及在甲醛固定、石蠟包埋的腎活檢中，酶消化法依舊不可替代。
抗原熱修復(fù)是采用高溫、高壓方法配合合適的抗原修復(fù)液，使得被固定液封閉的抗原位點(diǎn)重新暴露，提高抗體的陽性檢出率。
最常用的抗原修復(fù)液有兩種：檸檬酸鈉緩沖液（pH=6）、EDTA緩沖液（pH=8或9），一般來說一抗的說明書都會寫明需要選擇哪種修復(fù)液。如果說明書沒有推薦，檸檬酸鈉緩沖液能夠適配大部分的抗體，EDTA緩沖液相對修復(fù)效果更強(qiáng)，但陽性增強(qiáng)的同時(shí)也會提高非特異背景，一些比較難表達(dá)的抗體可以選擇EDTA緩沖液。
常見熱修復(fù)方法對比
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熱修復(fù)方法 |
微波熱修復(fù) |
水浴熱修復(fù) |
高壓熱修復(fù) |
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操作 |
在染色盒中加入抗原修復(fù)液，放入切片，置于微波爐中高火煮沸，低火維持15min后取出染色盒，冷卻至室溫 |
在染色盒中加入抗原修復(fù)液，放入切片，置于水溶鍋中加熱，其間不斷用溫度計(jì)測其溫度，待抗原修復(fù)液的溫度達(dá)到有效溫度（92℃↑），維持40min后取出染色盒，冷卻至室溫 |
在染色盒中加入抗原修復(fù)液，放入切片，置于高壓鍋內(nèi)加熱至飽壓后繼續(xù)加熱5min，關(guān)閉電源，10min后取出染色盒，冷卻至室溫 |
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優(yōu)點(diǎn) |
加熱的時(shí)間和溫度都可以有所調(diào)整 |
溫和，均勻，不易脫片，對組織形態(tài)結(jié)構(gòu)影響少 |
受熱均勻，暴露抗原位點(diǎn)效果好，受環(huán)境條件影響小，可重復(fù)性高 |
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缺點(diǎn) |
時(shí)間長，修復(fù)液容易蒸干，需要及時(shí)觀察補(bǔ)充；受熱容易不均勻，沸騰易導(dǎo)致脫片；不同微波爐功率有差異，難以標(biāo)準(zhǔn)化 |
需要較長時(shí)間；染色盒材料不同，熱傳導(dǎo)性不同，會影響加熱效果，容易出現(xiàn)抗原表達(dá)弱、陽性率低的結(jié)果 |
易導(dǎo)致脫片；使用高壓鍋要小心蒸汽燙傷，使用要規(guī)范謹(jǐn)防鍋內(nèi)蒸汽過飽和引發(fā)事故 |
小愛溫馨提示，沒有哪一種抗原修復(fù)液或者修復(fù)方法能夠適配所有的抗體和樣本，最佳條件還是需要在摸索實(shí)踐中確定哦！
