食品組學(xué)應(yīng)用：使用GC-MS對(duì)化合物進(jìn)行非靶向分析和統(tǒng)計(jì)分析

李丕
 
食品組學(xué)

感官組學(xué)和風(fēng)味組學(xué)是食品組學(xué)的重要分支，旨在分析可能對(duì)食物的味道和氣味起關(guān)鍵作用的化合物，同時(shí)表征其生成途徑，指導(dǎo)優(yōu)化加工工藝，還可以通過(guò)某種食品的感官和風(fēng)味特征評(píng)價(jià)其真實(shí)性。感官和風(fēng)味組學(xué)的關(guān)鍵實(shí)施要素是將先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)與感官分析和嗅覺測(cè)量相結(jié)合，使用GC-MS結(jié)合化學(xué)計(jì)量方法對(duì)芳香化合物進(jìn)行非靶向分析和統(tǒng)計(jì)。

以下通過(guò)5個(gè)案例介紹賽默飛GC-MS家族在啤酒、羊肉、茶葉、精油風(fēng)味組學(xué)和橙汁真實(shí)性的應(yīng)用。
 
01
啤酒風(fēng)味 - ISQ

揮發(fā)性有機(jī)化合物 (VOC) 直接影響啤酒的風(fēng)味。它們與釀造原材料、酵母代謝、微生物污染和老化有關(guān)。因此將啤酒的化學(xué)組成與產(chǎn)品評(píng)估相結(jié)合以闡釋VOC 對(duì)啤酒香氣/接受度的影響非常重要。

巴西坎皮納斯大學(xué)化學(xué)研究所的Paiva使用全二維氣流調(diào)制器與ISQ7000聯(lián)用，搭建GC×GC-MS分析平臺(tái)對(duì)市場(chǎng)上的啤酒進(jìn)行風(fēng)味組學(xué)研究，研究成果發(fā)表在色譜A雜志[1]。

該工作根據(jù)Untappd® 平臺(tái)的啤酒平均等級(jí)得分（0-5分）選定樣品，共2組：第 1組平均評(píng)分低于 3 ，是消費(fèi)者偏好較低的啤酒；第 2組平均評(píng)分大于3，是公眾偏好度高的啤酒。風(fēng)味物質(zhì)的萃取富集通過(guò)TriPlus RSH自動(dòng)進(jìn)樣器的HS-SPME組件完成（DVB/CAR/PDMS 萃取頭），隨后通過(guò)ISQ7000進(jìn)行非靶向分析。


通過(guò)NIST譜庫(kù)結(jié)合RI做峰定性鑒定，然后通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)手段對(duì)化合物做差異性分析。

在第 2 組啤酒樣品中發(fā)現(xiàn)29 種組分濃度高于第1組，主要是非氧化單萜和含氧萜烯。萜烯是啤酒花精油中最豐富的揮發(fā)性化合物，它們對(duì)麥芽汁表現(xiàn)出高親和力，可能會(huì)進(jìn)入啤酒對(duì)其風(fēng)味產(chǎn)生影響，因此是啤酒釀造商很感興趣的化合物。另外，發(fā)現(xiàn)2-乙基-1-己醇和 2-十一烷醇僅在第 2 組啤酒樣品中存在， 2-十一烷醇賦予啤酒新鮮和菝葜屬性。
 
最后，使用TriPlus RSH 、全二維氣流調(diào)制器與ISQ7000聯(lián)用，可以生成與香氣相關(guān)的指紋，并闡釋造成消費(fèi)者喜好差異的化合物分子，是研究消費(fèi)者對(duì)拉格啤酒偏好的有趣解決方案。
   
02
羊肉風(fēng)味 – GC-Orbitrap 聯(lián)合 LC-Orbitrap

風(fēng)味和香氣感覺不僅來(lái)自揮發(fā)性化合物，而且還歸因于非揮發(fā)性物質(zhì)以及釋放揮發(fā)性化合物的基質(zhì)類型。中國(guó)農(nóng)科院北京畜牧獸醫(yī)研究所張軍民團(tuán)隊(duì)對(duì)高肌內(nèi)脂肪 (IMF)和低 IMF 胡羔羊進(jìn)行了脂質(zhì)組學(xué)和揮發(fā)性組學(xué)分析，旨在詳細(xì)說(shuō)明具有不同 IMF 含量的個(gè)體的脂質(zhì)和香氣化合物譜的變化，并確定導(dǎo)致羊肉香氣譜差異的脂質(zhì)，研究成果發(fā)表在Food Chemistry 雜志[2]。

該研究通過(guò)LC-Orbitrap/MS詳細(xì)闡明具有不同 IMF 含量的羊肉的脂質(zhì)類別和脂質(zhì)分子譜，總共確認(rèn)了 842 種脂質(zhì)，其中79 種分子受到IMF含量影響而在各組之間存在差異；通過(guò)GC-Orbitrap/MS 在60,000 FWHM分辨率全掃描模式鑒定和半定量了羊肉中55種香氣化合物，其中15種化合物（主要來(lái)自脂質(zhì)氧化）對(duì)羊肉的整體香氣影響最大；最后使用偏最小二乘回歸 (PLS-R) 確定芳香化合物與脂質(zhì)之間的關(guān)系。
 
定性識(shí)別

其中芳香化合物的定性鑒定是通過(guò)與 NIST和 Wiley 譜庫(kù)、自動(dòng)計(jì)算線性保留指數(shù)及差值、和風(fēng)味標(biāo)準(zhǔn)品比較得到的，半定量則通過(guò)使用內(nèi)標(biāo)（2-甲基-3-庚酮）進(jìn)行。
 
定量測(cè)定

值得一提的是，對(duì)于氣味活性值 (OAV) > 1 的芳香化合物，通過(guò)空白基質(zhì)匹配曲線來(lái)準(zhǔn)確定量，特征離子(m/z)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品確定，標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍為 10 mg/L 至 2 g/L，R2 > 0.99。
 
一次進(jìn)樣，兼具非靶向和靶向分析

本工作中GC-Orbitrap/MS以全掃描模式采集數(shù)據(jù)，后處理時(shí)，既可以對(duì)全掃描譜圖通過(guò)非靶向篩查方法對(duì)未知物定性表征，也可以從全掃描譜圖中提取關(guān)鍵化合物特征離子通過(guò)靶向方法進(jìn)行定量，而無(wú)需二次進(jìn)樣。

 
03
橙汁真實(shí)性 – GC-Orbitrap
食品真實(shí)性是全世界都非常關(guān)注的領(lǐng)域。用濃縮（FC）橙汁代替非濃縮（NFC）橙汁是一種新的摻假問題。中國(guó)檢科院的陳穎教授團(tuán)隊(duì)使用HS-SPME-GC-Orbitrap/MS結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)來(lái)區(qū)分NFC和 FC 橙汁，旨在研究 NFC 和 FC 橙汁之間的差異，探索橙汁加工過(guò)程中差異揮發(fā)性化合物形成的根本原因，研究成果表在 LWT 雜志[3]。
 
定性識(shí)別

化合物的識(shí)別鑒定通過(guò)NIST檢索評(píng)分 (RSI) 、及GC-Orbitrap獨(dú)有的高分辨率過(guò)濾 (HRF) 評(píng)分進(jìn)行，并通過(guò)TraceFinder軟件自動(dòng)計(jì)算線性保留指數(shù)及差值輔助定性。共鑒定出71種揮發(fā)性化合物。
 
差異分析

共分析了 126 個(gè)果汁樣品中的 71 種揮發(fā)性化合物，通過(guò)內(nèi)標(biāo)法半定量篩選出 25 種差異性組分，由6種醇、8種萜烯、9種酯和2種酮組成，可用于區(qū)分 NFC 橙汁和 FC 橙汁。
 
關(guān)鍵組分與加工工藝探討

結(jié)合果汁加工階段探討了25種關(guān)鍵化合物的具體變化，結(jié)果表明濃縮處理是導(dǎo)致 NFC 和 FC 橙汁揮發(fā)性成分差異的關(guān)鍵加工步驟，濃縮處理后，F(xiàn)C橙汁中這些化合物的濃度顯著降低；熱滅菌導(dǎo)致的變化程度遠(yuǎn)小于濃縮。
 
真實(shí)性評(píng)價(jià)

基于 25 種差異化合物構(gòu)建 PLS-DA 模型并用于商業(yè)橙汁鑒定。分析了29種商品橙汁（14種NFC和15種FC），結(jié)果顯示所有的商品NFC樣本都與標(biāo)簽一致；而15個(gè)商品FC樣本中有2個(gè)被錯(cuò)誤的檢測(cè)為NFC，這是因?yàn)檫@2個(gè)誤判的樣本中添加了橙漿，橙漿與橙汁中揮發(fā)性組分的濃度呈正相關(guān)。該項(xiàng)研究證明，使用 HS-SPME-GC-MS 結(jié)合化學(xué)計(jì)量分析在NFC 和 FC 橙汁鑒別方面具有巨大潛力。

 
04
茶葉香氣 – GC-Orbitrap 結(jié)合

Compound Discoverer

我們采用Orbitrap Exploris GC結(jié)合HS-SPME Arrow分析多個(gè)不發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶和發(fā)酵茶樣品，通過(guò)Compound Discoverer組學(xué)分析軟件的非靶向workflow自動(dòng)進(jìn)行解卷積和定性分析，包括EI和PCI聯(lián)合預(yù)測(cè)驗(yàn)證，得到最準(zhǔn)確的分析結(jié)果，該方法可廣泛用于非靶向風(fēng)味組學(xué)的研究中。


差異香氣化合物

與其他品種茶葉樣品比較，正山小種的香氣特征為鐮葉芹醇、可卡醛等；福鼎白茶為 α-柏木烯，植酮等。

 
定性確證

以RT=27.843min的化合物為例，EI workflow解卷積定性為2-乙�；�吡咯（食用香精，可用于茶葉），總得分97，HRF得分99.4，相似度指數(shù)（SI）861。接著用PCI workflow進(jìn)一步驗(yàn)證，軟件可根據(jù)反應(yīng)氣類型自動(dòng)尋找分子離子M+= 109.05269，并在Predict Compositions節(jié)點(diǎn)自動(dòng)預(yù)測(cè)可能的化學(xué)式為C6H7NO，并預(yù)測(cè)同位素離子豐度與實(shí)測(cè)質(zhì)譜圖比對(duì)。最后利用ChemSpider節(jié)點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)式檢索，得到的匹配結(jié)果信息為2-乙�；�吡咯，這與EI定性結(jié)果一致。
   
EI/CI自由切換，拒絕宕機(jī)

EI結(jié)合PCI雙重定性需要切換EI和CI離子源。賽默飛具有獨(dú)特的VPI技術(shù)，可以在不破壞質(zhì)譜真空的情況下2分鐘之內(nèi)切換EI源和CI源，5分鐘內(nèi)更換色譜柱，消除宕機(jī)時(shí)間，輕松實(shí)現(xiàn)EI/PCI聯(lián)合定性或雙柱RI定性。
 
05
植物精油 – GC×GC-Orbitrap

精油具有香氣和抗菌性，因此作為天然調(diào)味劑和抗菌劑用于食品。收獲季節(jié)、地理來(lái)源、萃取方式都會(huì)影響精油組成，造成其感官特征和抗菌性能的差異。有必要對(duì)精油中痕量化合物進(jìn)行表征和差異分析。
我們搭建了GC-Orbitrap/MS與全二維固態(tài)調(diào)制器聯(lián)用平臺(tái)，通過(guò)全自動(dòng)的非靶向分析流程，對(duì)共流出化合物進(jìn)行有效分離定性，為未知物的分離鑒定提供新的思路和方法。
 
GC×GC全二維分離

在二維TIC圖中，可以看到多個(gè)一維保留時(shí)間完全一致的組分簇（如：RT 43.903min，RT=50.203min）。本實(shí)驗(yàn)中使用全二維氣相色譜通過(guò)串聯(lián)兩根不同極性的色譜柱，在第二個(gè)維度上實(shí)現(xiàn)了一維共流出化合物的分離，一針進(jìn)樣實(shí)現(xiàn)雙柱分離的效果，很大程度上簡(jiǎn)化了從復(fù)雜樣品中鑒定未知化合物的流程（圖5-1）。

 
寬動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)準(zhǔn)確定性

高分辨質(zhì)譜在未知化合物分析中最大的優(yōu)勢(shì)之一，在于可以通過(guò)化合物實(shí)測(cè)的精確質(zhì)量數(shù)對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行推斷。在TIC圖中選取主要成分乙酸冰片酯和痕量組分丁香酚（比主成分低4個(gè)數(shù)量級(jí)），查看二者的精確質(zhì)量數(shù)測(cè)量結(jié)果（圖5-3和5-4）。結(jié)果顯示，二者的實(shí)測(cè)離子和同位素離子的質(zhì)量偏差均小于2ppm。

 
綜上，GC×GC-Orbitap/MS在精油樣品定性分析中表現(xiàn)優(yōu)異，通過(guò)全自動(dòng)的解卷積非靶向分析流程，無(wú)論主成分還是痕量成分都可以準(zhǔn)確定性；全二維色譜提升了色譜分離能力，可得到更全面的樣品成分剖析信息。

 
小結(jié)

食品組學(xué)分析通常使用先進(jìn)的數(shù)據(jù)分析方法，適當(dāng)?shù)姆治鰞x器也是重要因素。如今食品組學(xué)離不開質(zhì)譜法，對(duì)于揮發(fā)性或半揮發(fā)性的化合物，使用是氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）法。賽默飛提供全線氣相色譜質(zhì)譜產(chǎn)品，包含氣相色譜、四極桿質(zhì)譜及高分辨靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜，并配套定量、定性、組學(xué)分析軟件，提供完善可靠的分析流程。



參考文獻(xiàn)：
[1].https://doi.org/10.1016/j.chroma.2020.461529
[2].https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.132611
[3].https://doi.org/10.1016/j.lwt.2022.113504

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