賽默飛高分辨質(zhì)譜儀食品組學(xué)應(yīng)用：不同飼料組成對(duì)牛奶組分的影響

史碧云

專家說(shuō)：要增強(qiáng)抵抗力。

■ 在“二十條”和“新十條”先后發(fā)布后，各地響應(yīng)號(hào)召，對(duì)疫情防控措施進(jìn)行了優(yōu)化，面對(duì)從嚴(yán)格預(yù)防感染的戰(zhàn)略轉(zhuǎn)為重點(diǎn)關(guān)注重癥和預(yù)防死亡，在此基礎(chǔ)上讓社會(huì)生活和經(jīng)濟(jì)活動(dòng)逐步回歸正常，然而對(duì)于病毒的預(yù)防仍不可忽視，首要的方法就是增強(qiáng)抵抗力。
 
如何有效增加抵抗力呢？

攝入優(yōu)質(zhì)蛋白是增強(qiáng)抵抗力的核心方式，蛋白質(zhì)最普遍的來(lái)源便是牛奶。奶牛的飼喂系統(tǒng)對(duì)于牛奶的質(zhì)量至關(guān)重要，意大利圣心天主教大學(xué)和薩薩里大學(xué)聯(lián)合使用食品組學(xué)的方式評(píng)估了不同飼喂系統(tǒng)對(duì)牛奶化學(xué)成分的影響，多變量統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果提示牛奶樣品同奶牛飲食配方中的高水分穗玉米（HMC）相關(guān)性較大，差異代謝物主要同嘧啶和維生素B6的代謝途徑有關(guān)，這些同奶牛瘤胃到乳腺的微生物氮代謝相關(guān)。
   
玉米為典型的高產(chǎn)作物，其播種面積大，分布范圍廣，也是最主要的飼用谷物。在奶牛的飼喂系統(tǒng)中，經(jīng)常使用的是青貯玉米，即在最佳收獲期將包括果穗在內(nèi)的玉米地上部植株收獲，經(jīng)過(guò)整株切碎、加工或貯藏發(fā)酵，形成青貯玉米，也叫高水分玉米青貯（High-moisture ear corn, HMC），然后以一定比例配置成草食家畜的飼料作物。
 
研究者從意大利波河平原的66個(gè)商業(yè)奶牛牧場(chǎng)隨機(jī)選取了36個(gè)，其奶牛種和飼養(yǎng)環(huán)境均十分接近，只是飼料選擇有所不同，如下表所示；于每個(gè)牧場(chǎng)取牛奶樣品3份，進(jìn)行小分子代謝物提取，過(guò)程如下圖所示。




 
使用LC-HRAM MS進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，儀器方法如下圖所示，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、對(duì)齊、空缺值填充等，并使用5ppm作為質(zhì)量偏差閾值，進(jìn)行結(jié)合MS1、同位素峰簇分布及MS2信息的鑒定，使用Bovine Metabolome Database、Phenol-Explorer和Mass Bank of North America等數(shù)據(jù)庫(kù)，得到697個(gè)包含同位素峰簇的特征峰，其中88個(gè)獲得結(jié)構(gòu)鑒定的化合物信息，包括氨基酸、小肽段、碳水化合物及其衍生物、核酸衍生物、吡啶衍生物，以及馬尿酸衍生物和酚類代謝物等同飼料相關(guān)的化合物。



此后，使用有監(jiān)督的多變量統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，OPLS-DA散點(diǎn)圖如下所示，可見牛奶樣品代謝組的聚合程度同飼料的組成有關(guān)，飼料中有HMC的聚集程度較高，而其它無(wú)HMC的飼料則分散于不同象限內(nèi)。OPLS-DA的結(jié)果提示基于HMC的飼喂系統(tǒng)對(duì)于牛奶樣品的代謝組學(xué)特征有關(guān)鍵性影響。因此，下一步工作是基于飼料中包含和不包含HMC的牛奶之間進(jìn)行成對(duì)比較，即將1+4+6組合并為HMC組，同2,3,5組分別比較，并引入通路富集分析，以便更深入地了解引起聚合度分離的代謝物及通路信息。
 
使用VIP>0.8為代謝物判別能力的閾值，得到HMC和其它各組中，差異性最明顯的為小肽類及其衍生物（71種特征峰），其次是嘧啶衍生物（38種）、嘌呤衍生物（15種）、吡啶衍生物（14種），以及一些必需或非必需氨基酸（10種）。通路富集分析的結(jié)果見下圖（其中A圖為富集差異化合物通路，B圖為富集差異化合物種類），無(wú)論從通路還是從化合物種類來(lái)看，嘧啶衍生物都是最顯著（p<0.05）的類別，GDP、L-天冬氨酸、胸腺苷和4-吡哆酸都被發(fā)現(xiàn)在HMC的樣品中豐度較高且差異顯著。




基于多變量統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果，針對(duì)HMC特征性最明顯的代謝途徑探索，分別對(duì)HMC和組2,3,5進(jìn)行代謝組富集分析，選擇的通路庫(kù)為KEGG中的Bos Taurus庫(kù)，結(jié)果如下圖所示，其中A,B,C圖分別代表HMC vs 組2、組3和組5。結(jié)果提示3種代謝途徑對(duì)于HMC組較為主要，即嘧啶代謝、VB6代謝（即吡哆醛衍生物）和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。其中嘧啶代謝對(duì)每組對(duì)比的影響都是最大的，故下一步工作是基于對(duì)每個(gè)嘧啶代謝中間體的變化進(jìn)行評(píng)估，以證明它們同飼喂策略之間的相關(guān)性。




 
由結(jié)果可見，胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶的中間體包括脲基琥珀酸（VIP=1.25）、L-天冬氨酸（VIP=1.24）和乳清酸（VIP=1.39）。有趣的是，一些最重要的胸苷降解產(chǎn)物如 3-脲基異丁酸和 3-氨基異丁酸顯示出顯著積累，HMC vs組2的比較發(fā)現(xiàn) 3-氨基異丁酸的log2 FC = 0.63，HMC vs 組5的log2 FC = 0.34，HMC vs組3的log2 FC = 0.30，所有的比較都顯示FC高于1.23倍，且有顯著性差異。胞嘧啶和尿嘧啶的降解產(chǎn)物3-脲基丙酸也可觀察到類似的趨勢(shì)，盡管其FC值較低。
 
最后，考慮到每次比較都強(qiáng)調(diào)了維生素B6代謝的顯著差異，對(duì)其在Bos Taurus 代謝途徑中VB6 中間體4-吡哆酸進(jìn)行差異比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同對(duì)比組中都有顯著的積累趨勢(shì)。其中在HMC vs組 2（log2FC = 0.18）中發(fā)現(xiàn) 4-吡哆酸的最高積累，然后是與組3和組5的差異。綜上所述，研究結(jié)果支持基于HMC的飼喂系統(tǒng)與牛奶中嘧啶和吡哆醛降解產(chǎn)物的積累之間存在直接相關(guān)性。
 
除了我們熟知的食品安全、營(yíng)養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，對(duì)于飼喂系統(tǒng)和乳質(zhì)產(chǎn)品之間的相關(guān)性信息挖掘是不是也讓各位小伙伴大開眼界呢，對(duì)于食品組學(xué)的應(yīng)用還遠(yuǎn)不止于此。誠(chéng)然，所有應(yīng)用的前提都是高水平的平臺(tái)，賽默飛多年來(lái)提供多種高分辨率高質(zhì)量精度質(zhì)譜的選擇，對(duì)于食品組學(xué)可選擇新一代靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，附帶AcquireX的方法模板，可使數(shù)據(jù)挖掘到前所未有的深度，感興趣的小伙伴識(shí)別下方二維碼查看哦~    
 
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