Nature|DNA甲基化測序助力人多能干細(xì)胞向胚胎全能8細(xì)胞的人工誘導(dǎo)
北京時(shí)間2022年3月22日凌晨，《Nature》期刊在線刊登了由中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)學(xué)與健康研究所等單位牽頭，深圳市易基因科技有限公司、中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)等單位參與，應(yīng)用人多能干細(xì)胞向胚胎8細(xì)胞狀態(tài)人工誘導(dǎo)的科研成果。深圳市易基因科技有限公司運(yùn)用簡化基因組甲基化測序、單細(xì)胞和微量細(xì)胞基因組DNA甲基化測序等技術(shù)，完成了研究中不同人工干預(yù)及細(xì)胞狀態(tài)下的基因組DNA甲基化的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化。
圖源Nature官網(wǎng)
論文中，研究者設(shè)計(jì)了一種非轉(zhuǎn)基因、快速、可控的“細(xì)胞重編程”方法，將人的多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為全能性的8細(xì)胞期胚胎樣細(xì)胞，重編程形成的8CLC在轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳修飾上與人類8細(xì)胞胚胎十分類似。
首先，研究者通過人類胚胎干細(xì)胞(ESC)篩選了針對信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和表觀遺傳途徑的抑制劑，以逐漸確定產(chǎn)生8CLC的允許培養(yǎng)條件。在第一輪中，研究者將MEK抑制劑PD0325901 (PD)，tankyrase抑制劑IWR1和人LIF跟化學(xué)培養(yǎng)基結(jié)合，獲得具有原始多能干細(xì)胞樣克隆形態(tài)和基因表達(dá)的人多能干細(xì)胞(圖1)。在第二輪中，研究者結(jié)合這種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，測試了14種額外的添加成分，其中組蛋白H3K27甲基化轉(zhuǎn)移酶EZH2抑制劑DZNep和I類組蛋白去乙�；窰DAC抑制劑TSA的添加，顯著提升多潛能相關(guān)基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)化過程經(jīng)過約12天(3代)，無明顯細(xì)胞死亡(圖1)。 研究者將這種原始培養(yǎng)基命名為4CL(4種化學(xué)物質(zhì)+ LIF)，并在多個(gè)雄性和雌性ESC和iPSC細(xì)胞系中驗(yàn)證了它的有效性，觀察到達(dá)15代沒有明顯核型異常的干細(xì)胞維持。
研究者進(jìn)一步觀察4CL中TSA和DZNep劑量的增加對原始多能干細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 5天后，這種增強(qiáng)的4CL培養(yǎng)基(e4CL)促進(jìn)了TPRX1、ZSCAN4、ZSCAN5B、DUXA/B和ZNF280A等全能性基因的表達(dá)，這些基因在不同的原始培養(yǎng)基中，在PSC細(xì)胞中表達(dá)量較低，尤其是在擴(kuò)展多能干細(xì)胞中(expanded pluripotent stem cells, EPSC)。
在e4CL培養(yǎng)基中，細(xì)胞的核型保持正常，但不能傳代進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，這可能與全能性細(xì)胞缺乏自我更新能力有關(guān)。 始發(fā)態(tài)細(xì)胞在e4CL中直接培養(yǎng)7天也可以激活全能性基因(圖1)，這種方法稱為直接e4CL（direct e4CL），以區(qū)別于階梯式的，首先是4CL，然后是e4CL轉(zhuǎn)化(階梯式e4CL)。
圖1始發(fā)態(tài)PSC在4CL、階梯e4CL和直接e4CL培養(yǎng)基形成naïve PSC和8CLC的示意圖
DNA甲基化是基因表達(dá)的重要調(diào)控因子，在早期胚胎發(fā)育、始發(fā)態(tài)向原始態(tài)多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，DNA甲基化將發(fā)生顯著動(dòng)態(tài)改變。已有研究報(bào)道，人工誘導(dǎo)過程DNA大范圍的去甲基化與基因組穩(wěn)定性的風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)。研究者通過與胚胎發(fā)育8細(xì)胞DNA甲基化對比，探究e4CL培養(yǎng)基用于8CLC細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，原始多能和全能性基因的甲基化變化情況。
首先，對始發(fā)態(tài)PSC、4CL 12天培養(yǎng)的原始態(tài)PSC和進(jìn)一步e4CL 5天培養(yǎng)，以及直接e4CL 7天培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行簡化基因組甲基化測序。結(jié)果顯示4CL 12天培養(yǎng)的原始態(tài)PSC甲基化水平比始發(fā)態(tài)PSC甲基化水平更低（圖2a），且與各種已發(fā)表的誘導(dǎo)技術(shù)相比，4CL 12天培養(yǎng)的原始態(tài)PSC基因組印跡位點(diǎn)與胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán) (ICM) 相似性程度更高（圖2b） 。直接e4CL 7天培養(yǎng)細(xì)胞甲基化水平與胚胎8細(xì)胞甲基化水平相似（圖2a）。
圖2、簡化基因組甲基化對不同培養(yǎng)條件細(xì)胞整體甲基化檢測（a）及印記基因CG甲基化檢測（b）.
此外，通過對8CLC細(xì)胞，4CL 12天培養(yǎng)原始PSC細(xì)胞以及始發(fā)態(tài)PSC細(xì)胞進(jìn)行全基因組單/微量細(xì)胞甲基化測序，結(jié)果顯示，8CLC甲基化水平比4CL 12天培養(yǎng)的原始PSC或始發(fā)態(tài)PSC細(xì)胞甲基化水平更低，跟8細(xì)胞胚胎甲基化水平相當(dāng)（圖3a）。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、gene bodies和特定基因元件（如增強(qiáng)子、CG島、LTR、SINE、LINE、intergenic和intragenic等），8CLC甲基化水平也同樣比4CL 12天培養(yǎng)的原始PSC或始發(fā)態(tài)PSC細(xì)胞甲基化水平低（圖3b，c）。
圖3、始發(fā)態(tài)PSC、4CL和8CLC微量/單細(xì)胞全基因組甲基化測序甲基化水平分析
無論是簡化基因組甲基化測序結(jié)果還是微量細(xì)胞全基因組甲基化測序，原始多潛能基因和全能基因甲基化水平都保持相對一致水平(圖4)。
圖4、全基因組甲基化測序分析原始多潛能基因（藍(lán)色）和全能基因（紅色）甲基化狀態(tài)改變
為進(jìn)一步探索8CLC細(xì)胞形成分子機(jī)制，研究者分析了不同細(xì)胞狀態(tài)的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)449個(gè)基因表達(dá)在8CLC中上調(diào)，幾乎無下調(diào)基因。其中DPPA3和TPRX1基因處于上調(diào)前五基因內(nèi)。已知DPPA3與UHRF1及DNMT1作用，控制小鼠卵母細(xì)胞被動(dòng)去甲基化過程。DPPA3也通過調(diào)控印記基因甲基化修飾，參與到小鼠體細(xì)胞重編程過程。作者敲除DPPA3基因阻斷了始發(fā)態(tài)PSC細(xì)胞向原始態(tài)PSC細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。敲除TPRX1基因阻斷了階段式e4CL和直接e4CL誘導(dǎo)8細(xì)胞胚胎標(biāo)志物的形成，但是對4CL 12天培養(yǎng)原始態(tài)PSC的形成影響不大。與上述結(jié)果相對應(yīng)，DPPA3基因敲除后，4CL 12天和e4CL 直接7天細(xì)胞基因組DNA甲基化整體升高（圖5a）。DPPA5和KHDC3L等原始多潛能基因，以及TPRX1和TRIM43等全能基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域DNA甲基化在DPPA3敲除后都升高（圖5b-d）。DPPA3敲除后，基因間區(qū)DNA甲基化同樣升高（圖5e），提示其作為遠(yuǎn)端調(diào)節(jié)區(qū)域和3D染色質(zhì)相互作用的潛在位點(diǎn) 。表明8CLC轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞功能和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重組發(fā)生了重大變化。
圖5、DPPA3基因敲除后不同細(xì)胞甲基化變化
“這些全能性的8細(xì)胞期胚胎樣細(xì)胞重建了受精卵僅分裂3次后的胚胎狀態(tài)，相比過去的多能干細(xì)胞，這種細(xì)胞可以分化為胎盤組織，并可能發(fā)育為更成熟的各類身體組織，為全世界數(shù)百萬需要進(jìn)行器官移植的患者帶來了福音。”論文的通訊作者，中國科學(xué)院Miguel A. Esteban教授、Md. Abdul Mazid博士和李文娟博士表示。
深圳市易基因科技有限公司聯(lián)合創(chuàng)始人，也是項(xiàng)目主要參與者王君文博士表示：表觀遺傳特別是DNA甲基化調(diào)控在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。哺乳動(dòng)物受精后，精子首先經(jīng)歷一個(gè)快速去甲基化過程。隨后，卵子來源基因組DNA在2細(xì)胞到8細(xì)胞發(fā)育期間進(jìn)一步去甲基化，直到桑葚胚，整個(gè)受精卵基本完成甲基化去除。在隨后的約囊胚期，整個(gè)受精卵在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3A和DNMT3B等一系列酶控作用下，精確完成DNA甲基化的重編程，調(diào)控細(xì)胞的定向發(fā)育。
參考文獻(xiàn)：
圖源Nature官網(wǎng)論文中，研究者設(shè)計(jì)了一種非轉(zhuǎn)基因、快速、可控的“細(xì)胞重編程”方法，將人的多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為全能性的8細(xì)胞期胚胎樣細(xì)胞，重編程形成的8CLC在轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳修飾上與人類8細(xì)胞胚胎十分類似。
首先，研究者通過人類胚胎干細(xì)胞(ESC)篩選了針對信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和表觀遺傳途徑的抑制劑，以逐漸確定產(chǎn)生8CLC的允許培養(yǎng)條件。在第一輪中，研究者將MEK抑制劑PD0325901 (PD)，tankyrase抑制劑IWR1和人LIF跟化學(xué)培養(yǎng)基結(jié)合，獲得具有原始多能干細(xì)胞樣克隆形態(tài)和基因表達(dá)的人多能干細(xì)胞(圖1)。在第二輪中，研究者結(jié)合這種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，測試了14種額外的添加成分，其中組蛋白H3K27甲基化轉(zhuǎn)移酶EZH2抑制劑DZNep和I類組蛋白去乙�；窰DAC抑制劑TSA的添加，顯著提升多潛能相關(guān)基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)化過程經(jīng)過約12天(3代)，無明顯細(xì)胞死亡(圖1)。 研究者將這種原始培養(yǎng)基命名為4CL(4種化學(xué)物質(zhì)+ LIF)，并在多個(gè)雄性和雌性ESC和iPSC細(xì)胞系中驗(yàn)證了它的有效性，觀察到達(dá)15代沒有明顯核型異常的干細(xì)胞維持。
研究者進(jìn)一步觀察4CL中TSA和DZNep劑量的增加對原始多能干細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 5天后，這種增強(qiáng)的4CL培養(yǎng)基(e4CL)促進(jìn)了TPRX1、ZSCAN4、ZSCAN5B、DUXA/B和ZNF280A等全能性基因的表達(dá)，這些基因在不同的原始培養(yǎng)基中，在PSC細(xì)胞中表達(dá)量較低，尤其是在擴(kuò)展多能干細(xì)胞中(expanded pluripotent stem cells, EPSC)。
在e4CL培養(yǎng)基中，細(xì)胞的核型保持正常，但不能傳代進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，這可能與全能性細(xì)胞缺乏自我更新能力有關(guān)。 始發(fā)態(tài)細(xì)胞在e4CL中直接培養(yǎng)7天也可以激活全能性基因(圖1)，這種方法稱為直接e4CL（direct e4CL），以區(qū)別于階梯式的，首先是4CL，然后是e4CL轉(zhuǎn)化(階梯式e4CL)。
圖1始發(fā)態(tài)PSC在4CL、階梯e4CL和直接e4CL培養(yǎng)基形成naïve PSC和8CLC的示意圖DNA甲基化是基因表達(dá)的重要調(diào)控因子，在早期胚胎發(fā)育、始發(fā)態(tài)向原始態(tài)多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，DNA甲基化將發(fā)生顯著動(dòng)態(tài)改變。已有研究報(bào)道，人工誘導(dǎo)過程DNA大范圍的去甲基化與基因組穩(wěn)定性的風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)。研究者通過與胚胎發(fā)育8細(xì)胞DNA甲基化對比，探究e4CL培養(yǎng)基用于8CLC細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，原始多能和全能性基因的甲基化變化情況。
首先，對始發(fā)態(tài)PSC、4CL 12天培養(yǎng)的原始態(tài)PSC和進(jìn)一步e4CL 5天培養(yǎng)，以及直接e4CL 7天培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行簡化基因組甲基化測序。結(jié)果顯示4CL 12天培養(yǎng)的原始態(tài)PSC甲基化水平比始發(fā)態(tài)PSC甲基化水平更低（圖2a），且與各種已發(fā)表的誘導(dǎo)技術(shù)相比，4CL 12天培養(yǎng)的原始態(tài)PSC基因組印跡位點(diǎn)與胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán) (ICM) 相似性程度更高（圖2b） 。直接e4CL 7天培養(yǎng)細(xì)胞甲基化水平與胚胎8細(xì)胞甲基化水平相似（圖2a）。
此外，通過對8CLC細(xì)胞，4CL 12天培養(yǎng)原始PSC細(xì)胞以及始發(fā)態(tài)PSC細(xì)胞進(jìn)行全基因組單/微量細(xì)胞甲基化測序，結(jié)果顯示，8CLC甲基化水平比4CL 12天培養(yǎng)的原始PSC或始發(fā)態(tài)PSC細(xì)胞甲基化水平更低，跟8細(xì)胞胚胎甲基化水平相當(dāng)（圖3a）。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、gene bodies和特定基因元件（如增強(qiáng)子、CG島、LTR、SINE、LINE、intergenic和intragenic等），8CLC甲基化水平也同樣比4CL 12天培養(yǎng)的原始PSC或始發(fā)態(tài)PSC細(xì)胞甲基化水平低（圖3b，c）。
圖3、始發(fā)態(tài)PSC、4CL和8CLC微量/單細(xì)胞全基因組甲基化測序甲基化水平分析
無論是簡化基因組甲基化測序結(jié)果還是微量細(xì)胞全基因組甲基化測序，原始多潛能基因和全能基因甲基化水平都保持相對一致水平(圖4)。
圖4、全基因組甲基化測序分析原始多潛能基因（藍(lán)色）和全能基因（紅色）甲基化狀態(tài)改變為進(jìn)一步探索8CLC細(xì)胞形成分子機(jī)制，研究者分析了不同細(xì)胞狀態(tài)的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)449個(gè)基因表達(dá)在8CLC中上調(diào)，幾乎無下調(diào)基因。其中DPPA3和TPRX1基因處于上調(diào)前五基因內(nèi)。已知DPPA3與UHRF1及DNMT1作用，控制小鼠卵母細(xì)胞被動(dòng)去甲基化過程。DPPA3也通過調(diào)控印記基因甲基化修飾，參與到小鼠體細(xì)胞重編程過程。作者敲除DPPA3基因阻斷了始發(fā)態(tài)PSC細(xì)胞向原始態(tài)PSC細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。敲除TPRX1基因阻斷了階段式e4CL和直接e4CL誘導(dǎo)8細(xì)胞胚胎標(biāo)志物的形成，但是對4CL 12天培養(yǎng)原始態(tài)PSC的形成影響不大。與上述結(jié)果相對應(yīng)，DPPA3基因敲除后，4CL 12天和e4CL 直接7天細(xì)胞基因組DNA甲基化整體升高（圖5a）。DPPA5和KHDC3L等原始多潛能基因，以及TPRX1和TRIM43等全能基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域DNA甲基化在DPPA3敲除后都升高（圖5b-d）。DPPA3敲除后，基因間區(qū)DNA甲基化同樣升高（圖5e），提示其作為遠(yuǎn)端調(diào)節(jié)區(qū)域和3D染色質(zhì)相互作用的潛在位點(diǎn) 。表明8CLC轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞功能和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重組發(fā)生了重大變化。
圖5、DPPA3基因敲除后不同細(xì)胞甲基化變化“這些全能性的8細(xì)胞期胚胎樣細(xì)胞重建了受精卵僅分裂3次后的胚胎狀態(tài)，相比過去的多能干細(xì)胞，這種細(xì)胞可以分化為胎盤組織，并可能發(fā)育為更成熟的各類身體組織，為全世界數(shù)百萬需要進(jìn)行器官移植的患者帶來了福音。”論文的通訊作者，中國科學(xué)院Miguel A. Esteban教授、Md. Abdul Mazid博士和李文娟博士表示。
深圳市易基因科技有限公司聯(lián)合創(chuàng)始人，也是項(xiàng)目主要參與者王君文博士表示：表觀遺傳特別是DNA甲基化調(diào)控在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。哺乳動(dòng)物受精后，精子首先經(jīng)歷一個(gè)快速去甲基化過程。隨后，卵子來源基因組DNA在2細(xì)胞到8細(xì)胞發(fā)育期間進(jìn)一步去甲基化，直到桑葚胚，整個(gè)受精卵基本完成甲基化去除。在隨后的約囊胚期，整個(gè)受精卵在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3A和DNMT3B等一系列酶控作用下，精確完成DNA甲基化的重編程，調(diào)控細(xì)胞的定向發(fā)育。
參考文獻(xiàn)：
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- Pastor, W. A. et al. Naive human pluripotent cells feature a methylation landscape devoid of blastocyst or germline memory. Cell Stem Cell 18, 323–329 (2016).
- Smith, Z. D. et al. DNA methylation dynamics of the human preimplantation embryo. Nature 511, 611–615 (2014).
- Wang, Y. et al. Single-cell multiomics sequencing reveals the functional regulatory landscape of early embryos. Nat Commun 12, 1247 (2021).
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