InnoScan生物芯片掃描儀在糖生物學(xué)的應(yīng)用

 
 
概述
 
聚糖陣列正在成為糖生物學(xué)的常規(guī)工具。本文對(duì) InnoScan 掃描儀聚糖和凝集素陣列的主要應(yīng)用進(jìn)行回顧。使用微陣列技術(shù)，InnoScan 掃描儀用戶(hù)可以獲得糖組學(xué)分析所需的自動(dòng)化 和高通量。與標(biāo)準(zhǔn)微孔板相比，微陣列技術(shù)具有巨大優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈兲峁┪⑿蛯?shí)驗(yàn)體系和多指標(biāo)檢測(cè)能力，從而節(jié)省寶貴的材料和試劑。本文對(duì)細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)和病毒學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了描述。
 
 
聚糖陣列基礎(chǔ)知識(shí)
 
 
聚糖多種細(xì)胞功能的生物學(xué)重要性眾所周知。聚糖和其他生物分子（尤其  是聚糖結(jié)合蛋白，GBP）之間的相互作用已被證明可以調(diào)節(jié)細(xì)胞與基質(zhì)相互作用，器官結(jié)構(gòu)支持和病原體與宿主相互作用等生物學(xué)進(jìn)程。 糖生物學(xué)是指研究聚糖及其糖蛋白、糖脂的結(jié)構(gòu)和功能。糖生物學(xué)的一個(gè)分支是研究聚糖與其他分子（蛋白質(zhì)、脂 質(zhì)等）之間的相互作用。目前研究聚糖 分子相互作用的方法包括基于孔板的實(shí)驗(yàn)，例如 ELISA 實(shí)驗(yàn)，其中測(cè)試一種聚糖與不同濃度聚糖結(jié)合分子的相互作用。盡管基于孔板的實(shí)驗(yàn)具有高特異性和靈敏度，但這些技術(shù)一次只能檢測(cè)一種聚糖。然而，由于聚糖和糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，有必要測(cè)試幾種聚糖，這使得基于孔板的測(cè)定使用成本很高。因此需要單次實(shí)驗(yàn)測(cè)試多種聚糖的高通量方法。目前微陣列點(diǎn)印方法能實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，也就是在一張芯片上同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本和多個(gè)指標(biāo)。聚糖陣列正成為篩選聚糖與其他分子相互作用的常規(guī)技術(shù)，尤其是聚糖結(jié)合蛋白 (GBP)。通過(guò)聚糖陣列，格里菲斯大學(xué)糖組學(xué)研究所的糖組學(xué)芯片平臺(tái)使用點(diǎn)印的微陣列進(jìn)行糖結(jié)合蛋白的高通量篩選和解析。使用InnoScan 1100 AL 掃描儀，芯片掃描過(guò)程完全自動(dòng)化，可檢測(cè)聚糖與聚糖結(jié)合蛋白之間的相互作用 ¹。
                                                            
 
典型的聚糖陣列分析如圖 1 所示 : A) 使用微陣列點(diǎn)樣儀將聚糖或凝集素固定在功能化玻璃載玻片上。固定通過(guò)共價(jià)結(jié)合或吸附，具體取決于基片表面性質(zhì)。 B) 聚糖結(jié)合分子（GBP、病毒、細(xì)胞或其他分子）與微陣列芯片孵育。 聚糖結(jié)合蛋白和聚糖之間的相互作用通過(guò)熒光染料檢測(cè), 聚糖結(jié)合蛋白在孵育步驟之前與熒光基團(tuán)偶聯(lián)，或者一旦孵育步驟完成后，加入針對(duì)聚糖結(jié)合分子的熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行檢測(cè)（ C）。D)微陣列掃描儀用于檢測(cè)熒光信號(hào)。 InnoScan掃描儀是自動(dòng)化熒光檢測(cè)的理想工具，能夠同時(shí)檢測(cè)兩種或三種熒光染料。 E) 然后使用 Mapix 軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析以量化熒光信號(hào)，該軟件與掃描儀配合使用確保熒光量化分析的自動(dòng)化。
 
 
應(yīng)用案例
 
聚糖陣列正在成為篩選聚糖結(jié)合分子的標(biāo)準(zhǔn)工具，其應(yīng)用范圍非常廣泛，從病毒診斷到癌癥研究和疫苗開(kāi)發(fā)（圖 2）。
   
 
病毒親和力測(cè)定
 
聚糖陣列可用于表征和監(jiān)測(cè)流感病毒。Scripps研究所的 McBride 等人開(kāi)發(fā)了一種   
48 陣列載玻片芯片，可同時(shí)檢測(cè) 6 種不同聚糖 與 6種 聚糖結(jié)合蛋白在8 種稀釋度下的相互作用，以監(jiān)測(cè)甲型流感病毒血凝素親合力特異性 ²。該測(cè)定旨在監(jiān)測(cè)禽病毒是否適應(yīng)人類(lèi)受體。由此產(chǎn)生的測(cè)定結(jié)果與微孔板測(cè)定相當(dāng)，但化合物和生物制品的消耗分別顯著減少 1,500 倍和 360 倍。
Scripps研究所使用 InnoScan 1100AL 進(jìn)行聚糖陣列分析。該研究團(tuán)隊(duì)采用三熒光通道同時(shí)掃描模式，來(lái)同時(shí)檢測(cè)芯片上的三種不同類(lèi)型樣品點(diǎn)；在芯片制造過(guò)程中使用 Atto488-NHS 染料作為網(wǎng)格標(biāo)記；采用鏈霉親和素-555 染料以標(biāo)記具有已知特異性的生物素化凝集素作為對(duì)照；最后，使用 Alexa 647 標(biāo)記的抗體來(lái)檢測(cè)甲型流感病毒血凝素的受體結(jié)合特異性。
 
免疫學(xué)研究
 
聚糖已被證明是調(diào)節(jié)病原體免疫反應(yīng)幾種機(jī)制的關(guān)鍵因素。免疫細(xì)胞的聚糖分析表明不同物種之間的聚糖結(jié)構(gòu)存在差異。Scripps研究所的 Paulson 教授團(tuán)隊(duì)使用凝集素陣列來(lái)研究小鼠和人類(lèi)兩種抗體的特異性，研究表明每個(gè)物種中 CD22 相關(guān) B 細(xì)胞的成熟存在差異³。即使該兩物種淋巴組織濾泡發(fā)生中心形成CD22 的最終結(jié)果相同，但小鼠和人類(lèi) B 細(xì)胞成熟的內(nèi)在機(jī)制有差異，這與每個(gè)物種CD22 聚糖結(jié)構(gòu)特異性有關(guān)。借助聚糖陣列，Paulson 教授團(tuán)隊(duì)首次表明人類(lèi) CD22 偏好硫酸化聚糖，而鼠類(lèi) CD22 偏好唾液酸 Neu5Gc。
 
細(xì)胞生物學(xué)研究
 
細(xì)胞糖基化分析對(duì)于更好地了解糖對(duì)細(xì)胞功能和命運(yùn)的作用是必要的。斯洛伐克科學(xué)院糖生物學(xué)系的 Katrlik 博士團(tuán)隊(duì)使用基于凝集素的細(xì)胞微陣列，來(lái)研究馬天然未培養(yǎng)壁顆粒細(xì)胞和體外培養(yǎng)壁顆粒細(xì)胞的糖萼。他們的創(chuàng)新方法包括在固定有不同凝集素的水凝膠載玻片上創(chuàng)建凝集素陣列，然后在載玻片上培養(yǎng)細(xì)胞以跟蹤細(xì)胞糖萼和凝集素之間的相互作用⁴。使用 InnoScan 710 掃描儀，該小組能夠研究細(xì)胞糖萼與不同濃度凝集素的親和力，從而確定細(xì)胞的糖基化概況。這種創(chuàng)新方法的優(yōu)勢(shì)在于能夠在其檢測(cè)中使用活細(xì)胞，從而降低聚糖提取過(guò)程中糖綴合物修飾的風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果通過(guò)經(jīng)典免疫組織化學(xué)測(cè)定法進(jìn)行驗(yàn)證。
 
 
結(jié)論
 
糖是許多細(xì)胞功能的關(guān)鍵分子，它們?cè)趶?fù)雜的多細(xì)胞器官和生物體的組裝中起著至關(guān)重要的作用，組裝過(guò)程需要細(xì)胞與周?chē)�基質(zhì)之間的相互作用。聚糖和糖綴合物是多種過(guò)程的調(diào)節(jié)分子，例如細(xì)胞分化和免疫。由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，糖組的研究需要高通量技術(shù)，以便在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中可測(cè)試多種聚糖形式。應(yīng)用于糖組分析的微陣列技術(shù)正在成為一種常規(guī)方法，因?yàn)樗�可在一張載玻片上同時(shí)檢測(cè)數(shù)百種聚糖形式。由于其微型化能力，聚糖陣列可以最大限度地減少珍貴材料和試劑的消耗，從而降低實(shí)驗(yàn)成本。InnoScan 掃描儀是聚糖陣列熒光檢測(cè)的最佳工具，可同時(shí)檢測(cè)兩種或三種染料。它們配備 24張載玻片自動(dòng)進(jìn)樣器，可提供糖組學(xué)分析所需的自動(dòng)化和高通量功能。
 
 
參考文獻(xiàn)
 
1)    Glycomics Array Facility, Institute for Glycomics,  Griffith University Website:  https://www.griffith.edu.au/science-  aviation/institute-glycomics/facilities/glycan-array
2)    McBride R., et al. A Miniaturized Glycan Microarray  Assay for Assessing Avidity and Specificity of  Influenza A Virus Hemagglutinins. J. Vis. Exp. (111),  e53847, doi:10.3791/53847 (2016)
3)    Macauley M.S., et al. Unmasking of CD22Co-receptor  on Germinal Center B-cells Occurs by Alternative  Mechanisms in Mouse and Man. J. Biol. Chem.  290(50):30066-30077, doi:  10.1074/jbc.M115.691337 (2015)
4)    Accogli G., et al. A lectin-based cell microarray  approach to analyze the mammalian granulosa cell  surface glycosylation profile. Glycoconj J. 33(5):717-  24. doi: 10.1007/s10719-016-9666-2 (2016)