脂肪間充質(zhì)干細胞ADSCs的介紹與其分離培養(yǎng)的詳細步驟

在普遍的認知中，大多數(shù)人會把脂肪當(dāng)作身體中一種不受歡迎的物質(zhì)，甚至與“肥胖”劃等號。隨著物質(zhì)生活水平的提高，人體內(nèi)攝入的卡路里越來越多，也就容易造成了肥胖。肥胖不僅影響形體的美觀，而且容易引發(fā)人體諸多疾病，世界衛(wèi)生組織（WHO）已將肥胖定義為慢性疾病。

其實，我們不必“談脂色變”，適量的脂肪是人體不可或缺的營養(yǎng)元素之一，除了為人體提供熱量，它還承擔(dān)著保護內(nèi)臟、影響內(nèi)分泌、抵御寒冷等多種功能。你或許還不知道，脂肪組織中還蘊藏著神秘又寶藏的黃金資源——脂肪間充質(zhì)干細胞，今天就帶你重新認識她。
 

ADSCs是什么？

脂肪間充質(zhì)干細胞（Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells, ADSCs），與其他種類的干細胞家族成員一樣具有強大的自我復(fù)制和多向分化潛能。作為一種成體干細胞，試想每個哺乳動物身上都擁有脂肪組織，而且脂肪組織來源的脂肪間充質(zhì)干細胞密度是骨髓中骨髓間充質(zhì)干細胞的500倍。那這個干細胞來源是不是很容易獲取、很豐富呢？另外，較其他種類間充質(zhì)干細胞，脂肪間充質(zhì)干細胞具有更強的旁分泌作用，在醫(yī)美美容相關(guān)的填充和修復(fù)應(yīng)用中發(fā)揮了積極作用。
 

脂肪組織結(jié)構(gòu)及其衍生物

ADSCs分離培養(yǎng)

了解了脂肪間充質(zhì)干細胞的故事，接下來我們一起來學(xué)習(xí)成人脂肪間充質(zhì)干細胞分離提取、傳代培養(yǎng)的全過程。

材料準備
樣本：健康成人的脂肪組織≥10mL, 采集時間≤48h，運輸保存溫度4℃。

試劑：OriCell^®PBS 100mL、OriCell^®成人脂肪間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基50mL、OriCell^®Collagenase Type I (0.1%) 一型膠原蛋白酶。

耗材：50mL無菌采集瓶一個、50mL離心管5-10個、10mL移液管4個、T75培養(yǎng)瓶若干個、T175培養(yǎng)瓶若干個、100μm細胞濾網(wǎng)1個。

脂肪清洗及膠原酶消化

1.1 生物安全柜內(nèi)打開脂肪采集瓶，將采集瓶內(nèi)的脂肪轉(zhuǎn)移至T175培養(yǎng)瓶中，加入OriCell^®PBS。脂肪和OriCell^®PBS的體積比為1:2，擰緊蓋子，劇烈晃動3min以充分洗滌脂肪組織，接著靜止3-5min，使不同相分離，吸去下層水相；重復(fù)以上操作，直至下層液較為清澈。

1.2 向T175培養(yǎng)瓶中加入體積比為1:2的新配制（提前半小時預(yù)熱）的125U/mL的OriCell^®Collagenase Type I (0.1%) 一型膠原蛋白酶溶液，封口膜封口，劇烈晃動離心管5~10秒，置于水浴振蕩器中，37℃，150rpm消化30min。

分離基質(zhì)血管組分（SVF）
1.3 將消化后的組織液，室溫900×g，離心10min，得到的沉淀即為SVF（Stromal Vascular Fraction）。

1.4 用移液管自上而下小心除去上層油脂和下層的膠原酶溶液。在SVF沉淀上方留下少量的溶液，以免擾動沉淀細胞。

洗滌基質(zhì)血管組分（SVF）
1.5 SVF沉淀中加適量OriCell^®PBS重懸細胞，吹散。室溫300×g，10min離心。

1.6 離心完后，小心吸去上清液。吸取時移液管頭應(yīng)該置于離心管的上部以便于徹底的出去油脂。

1.7 再向SVF沉淀中加入40mL的OriCell^®PBS重懸細胞。

1.8 100μm細胞濾網(wǎng)過濾細胞懸液到新的50mL的離心管中，去除未消化的纖維組織和其他雜質(zhì)。

1.9 過濾后的細胞懸液吹勻，室溫250×g，6min離心。

原代接種
2.0 離心后，用移液管吸取并去掉上清液。

2.1 用OriCell^®成人脂肪間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基重懸離心管中的細胞，接種T75培養(yǎng)瓶中，補足培養(yǎng)基到10mL/瓶。

2.2 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中37℃，5%CO₂條件培養(yǎng)。

換液操作
2.3 原代接種第二天進行第一次半量換液。

2.4 輕輕將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基倒入50mL離心管中，500×g，6min離心。

2.5 T75培養(yǎng)瓶中加入離心完畢的5mL舊培養(yǎng)基，5mL新OriCell^®成人脂肪間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基，半量換液完畢。

2.6 將培養(yǎng)瓶放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的CO₂培養(yǎng)箱中。

2.7 完成第一次換液后，每隔3天進行一次半量換液(可以根據(jù)生長情況適當(dāng)調(diào)整)。

傳代培養(yǎng)
（P0傳P1與P1后傳代的操作方法流程一致）
2.8 將完全培養(yǎng)基、PBS、胰酶預(yù)熱至37℃。

2.9 吸去培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基。用OriCell^®PBS(T25培養(yǎng)瓶加入約3mL，T75培養(yǎng)瓶加入約6mL)洗滌細胞2次，注意動作輕柔，清洗全面。吸去PBS。

3.0 加入胰酶(T25培養(yǎng)瓶加入約1.5mL，T75培養(yǎng)瓶加入約3mL)，迅速鋪勻，保證充分接觸細胞表面。

3.1 顯微鏡下觀察消化情況，約70%~80%細胞收縮變圓后，輕拍培養(yǎng)容器外壁，使細胞脫離培養(yǎng)表面。立即加入完全培養(yǎng)基(T25培養(yǎng)瓶加入約3mL，T75培養(yǎng)瓶加入約6mL)，隨即輕搖培養(yǎng)容器，使培養(yǎng)基和胰酶迅速混勻，終止消化。

3.2 使用吸管或移液管吸取細胞懸液，吹打培養(yǎng)容器底面數(shù)次，盡可能將細胞都吹打下來。

注意：吹打動作不可劇烈，避免產(chǎn)生大量氣泡，否則可能損傷和損失細胞。

3.3. 將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中。用OriCell^®PBS(T25培養(yǎng)瓶加入約3mL，T75培養(yǎng)瓶加入約6mL)洗滌容器1次，收集殘留細胞。

3.4. 收集的所有細胞懸液以250×g，離心4min。

3.5. 離心后去除上清。加入2mL完全培養(yǎng)基，輕柔吹打細胞沉淀，充分吹散、混勻。將細胞按(2.5~4)×10⁴個活細胞/cm² 接種至適宜的培養(yǎng)容器內(nèi)。

注意：培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細胞對于細胞密度有較高的要求，我們建議有條件且計數(shù)效率較高的情況下，進行手工計數(shù)，以期獲得精準的細胞濃度指導(dǎo)接種;在沒有精確計數(shù)條件的情況下，按照適宜比例傳代是更好的方法。通常脂肪間充質(zhì)干細胞傳代比例為1:3，72h內(nèi)生長至可傳代匯合度。請根據(jù)細胞實際生長情況調(diào)整傳代比例。

3.6. 搖勻細胞，放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的CO₂培養(yǎng)箱中。

3.7. 傳代次日，觀察細胞狀態(tài)。若發(fā)現(xiàn)較多漂浮細胞，應(yīng)予以換液。待細胞生長至90%匯合，即需傳代或凍存。