Plant Physiology：DAP-seq技術(shù)在水稻適應非生物脅迫研究中的應用

近日，中科院植物所王雷研究組在Plant Physiology期刊上發(fā)表了題為“Rice CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1 transcriptionally regulates ABA signaling to confer multiple abiotic stress tolerance”的研究成果。

該研究揭示了OsCCA1調(diào)控水稻適應鹽脅迫、干旱脅迫以及滲透脅迫的分子機制。其中，該研究使用了DNA親和純化測序技術(shù)（DAP-seq，DNA Affinity Purification Sequencing），鑒定了水稻生物鐘核心組分OsCCA1（Oryza sativa CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1）調(diào)控的下游靶基因。

研究背景
生物鐘組分和脫落酸（Abscisic Acid，ABA）在調(diào)控植物生長發(fā)育和適應逆境脅迫過程中具有重要作用，但生物鐘組分是否參與ABA信號轉(zhuǎn)導，目前還不清楚。
研究材料：
野生型水稻材料Dongjin（DJ）和OsCCA1功能缺失的突變體水稻（oscca1-L1和oscca1-L2）

研究結(jié)果：

圖1. 使用DAP-seq方法，在全基因組水平上鑒定OsCCA1的直接結(jié)合靶點。

A. 使用DAP-seq鑒定的OsCCA1關(guān)聯(lián)的基因數(shù)量及在全基因組的分布圖。

B. 使用MEME-CHIP分析OsCCA1結(jié)合的motif。

C和D. 使用EMSA驗證OsCCA1與SRZ1基因和OsPP2C09基因啟動子區(qū)的AAATATC motif的結(jié)合。

E. 使用DAP-seq鑒定的OsCCA1關(guān)聯(lián)基因KEGG富集結(jié)果。
 

圖2. 使用RNA-seq發(fā)現(xiàn)OsCCA1調(diào)節(jié)ABA響應基因的表達。

A. oscca1-L1突變體與Dongjin (DJ)相比，上調(diào)和下調(diào)基因的數(shù)量。

B. 鹽脅迫條件下oscca1-L1中DEGs富集最多的15個GO term。

C. oscca1-L1突變體中DEGs與ABA響應基因重疊的基因數(shù)量。紅色和藍色箭頭分別表示上調(diào)和下調(diào)的基因。

D. 熱圖顯示（C）中19個ABA響應基因的轉(zhuǎn)錄豐度。

E. 鹽脅迫下oscca1-L1中的DEGs重疊的OsPYLs基因（左）、A類OsPP2Cs基因（中）、SnRKs/SAPKs基因（右）。紅色和藍色箭頭分別代表表達上調(diào)和下調(diào)的基因。

圖3. OsCCA1直接調(diào)控ABA響應基因的表達。

A. 比較DAP-seq鑒定的靶基因與RNA-seq結(jié)果中，oscca1突變體中已鑒定的DEGs，將重合的基因作為OsCCA1的直接靶基因。

B. OsCCA1靶基因的前15個富集的GO term。

C. OsCCA1直接激活的靶基因與A類OsPP2C基因重疊的基因。oscca1突變體與DJ中5個重疊基因的轉(zhuǎn)錄豐度。

D. 通過DAP-seq檢測的OsCCA1在OsPP108p（-2625 bp）上結(jié)合峰（重復1和重復2）和陰性對照（mock）。

E. OsbZIP46是OsCCA1的靶基因，而且是OsCCA1突變體中下調(diào)基因和鹽脅迫反應基因中唯一的基因。

F. 通過DAP-seq檢測到的OsCCA1在OsbZIP46（-1263 bp）上結(jié)合峰(重復1和重復2)和陰性對照（mock）。

圖4. OsCCA1直接結(jié)合OsPP108和OsbZIP46的啟動子，并激活其轉(zhuǎn)錄。

A. 在正常條件和NaCl處理24小時后，Dongjin (DJ)和oscca1-Ls植株中OsPP108(左)和OsbZIP46(右)的轉(zhuǎn)錄水平。

B. 水稻原生質(zhì)體瞬時表達實驗表明，OsCCA1可激活OsPP108和OsbZIP46的轉(zhuǎn)錄活性。

C和D.  ChIP-qPCR檢測顯示OsCCA1結(jié)合OsPP108和OsbZIP46的啟動子。

E和F. EMSA結(jié)果顯示OsCCA1直接結(jié)合OsPP108和OsbZIP46啟動子的rCBS基序。

結(jié)論：
本研究使用DAP-seq和RNA-seq方法，揭示了水稻生物鐘核心組分OsCCA1通過直接結(jié)合和調(diào)控OsPP2Cs和OsbZIP46基因來協(xié)調(diào)ABA信號網(wǎng)絡增強水稻對多種非生物脅迫適應性的分子機制。該研究為生物鐘調(diào)控水稻耐逆性提供了新的理論依據(jù)，為研發(fā)具有多重抗逆性的水稻品種提供了設計育種的靶點和優(yōu)質(zhì)遺傳資源。