測(cè)序技術(shù)在mRNA質(zhì)量檢測(cè)中進(jìn)行poly A尾檢測(cè)的應(yīng)用

首先我們需要先回顧下3’端polyA尾的功能：保護(hù)帽結(jié)構(gòu)不被降解，與polyA結(jié)合蛋白、5’ Cap（帽結(jié)構(gòu)）和翻譯起始因子蛋白協(xié)同作用，啟動(dòng)蛋白質(zhì)的翻譯。多數(shù)mRNA的polyA長(zhǎng)度為50–200 nt，以維持正常的生物學(xué)功能。polyA尾的有無(wú)與長(zhǎng)度是mRNA藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一。
 

 

當(dāng)前polyA尾的檢測(cè)分為兩種思路：
 

① 與加帽率的分析策略類似，酶切后純化回收3’端polyA尾，隨后通過(guò)毛細(xì)管電泳（CE）、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、高效液相色譜（HPLC）或液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS），對(duì)polyA尾進(jìn)行定性和定量分析。
 

② 基于二代或三代測(cè)序技術(shù)表征polyA，已報(bào)道的測(cè)序方法包括TAIL-seq、PAL-seq、FLAM-Seq和PAIso-Seq等。

 

2018年諾華公司Beverly M等發(fā)表在Anal Bioanal Chem雜志的一篇文章，《Poly A tail length analysis of in vitro transcribed mRNA by LC-MS》，研究基于RNAse T1酶切與oligo dT磁珠純化得到polyA尾，使用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）檢測(cè)polyA尾長(zhǎng)度的分布，目前該策略是當(dāng)前mRNA體外制備工藝中較為常用的方法。

 

2022年Brouze A等發(fā)表在Wiley Interdiscip Rev RNA期刊的一篇綜述，《Measuring the tail: Methods for poly(A) tail profiling》，總結(jié)了利用二代（Illumina）或三代（PacBio）測(cè)序與RNA直接測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)polyA尾，可在分析polyA長(zhǎng)度分布的同時(shí)表征序列的完整性和準(zhǔn)確性。

 

01  基于內(nèi)切酶與LC-MS平臺(tái)的polyA尾檢測(cè)

 

1）mRNA樣品制備
 

一步法加尾：設(shè)計(jì)模板序列，包括不同長(zhǎng)度polyA尾（27-112 nt），體外轉(zhuǎn)錄（IVT）制備mRNA樣品。

酶法加尾：模板序列不包括polyA，使用大腸桿菌來(lái)源的polyA聚合酶進(jìn)行mRNA的加尾修飾。制備得到的mRNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)mRNA樣品的長(zhǎng)度和完整性。以10 nt和20 nt 的polyA為標(biāo)準(zhǔn)品。

 

2）RNAse T1酶切與磁珠純化
 

① 酶切：內(nèi)切酶RNAse T1可特異性地在單鏈RNA的鳥嘌呤核糖核苷酸（G）后進(jìn)行切割。100 pmol mRNA加熱至95℃后迅速降至25℃，隨后加入10×RNase H緩沖液、2 μl RNase T1酶（100 μl體系），37℃孵育3小時(shí)。

② 純化：通過(guò)polyA尾與oligo dT磁珠特異性結(jié)合進(jìn)行純化，使用0.1 M醋酸銨溶液清洗磁珠，隨后加入75%甲醇，80℃孵育1 min，洗脫polyA片段。③換液：通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除甲醇，重懸于含1%甲醇的0.1 mM EDTA溶液，用于LC-MS分析。

 

3）LC-MS分析
 

使用高分辨液相質(zhì)譜聯(lián)用儀，固定相為ACQUITY C18色譜柱，流動(dòng)相A為200 mM六氟異丙醇+8.15 mM三乙胺（pH 7.9），流動(dòng)相B為100%MeOH。

洗脫條件為：5%B洗脫1min，1-12 min內(nèi)B濃度由5%線性增加到25%，然后90%B沖洗1min后恢復(fù)5%B。紫外波長(zhǎng)設(shè)置為260 nm。

 

4）不同加尾方法得到的polyA尾長(zhǎng)度評(píng)估
 

與利用質(zhì)粒模板轉(zhuǎn)錄生成polyA相比，酶法加尾的mRNA樣品的出峰更寬，polyA尾長(zhǎng)度的分散性更大。

圖1 不同加尾方法得到的polyA尾分布（離子色譜圖）

 

5）HPLC與MS的分辨率
 

當(dāng)polyA長(zhǎng)度為27 nt時(shí)，高效液相色譜（HPLC）可有效分離相差一個(gè)腺苷的polyA，但當(dāng)堿基個(gè)數(shù)增加至64或100，HPLC未能有效分離相差一個(gè)腺苷的polyA（圖2a）。而質(zhì)譜（MS）可彌補(bǔ)這一缺陷，當(dāng)polyA長(zhǎng)度為100 nt，電噴霧質(zhì)譜圖可精確檢測(cè)任一不同分子量的polyA（即不同長(zhǎng)度的polyA），通過(guò)峰強(qiáng)度對(duì)polyA長(zhǎng)度分布進(jìn)行相對(duì)定量（圖2b）。

 

如上所述，文章介紹了一種分析mRNA polyA尾長(zhǎng)的方法。該方法基于RNase T1將polyA從mRNA序列上切割下來(lái)，通過(guò)dT磁珠特異性捕獲polyA，然后借助LC-MS的高分辨率，定量分析mRNA的polyA尾長(zhǎng)度分布。
 

基于該策略的可替代方法包括：根據(jù)核苷酸序列特性，使用其他RNA酶（如RNase A或RNase H）代替RNase T1，以獲得polyA片段，隨后通過(guò)毛細(xì)管電泳、HPLC對(duì)短核苷酸進(jìn)行分離與定量分析。

 

02  基于測(cè)序平臺(tái)的polyA尾檢測(cè)

 

有研究報(bào)道，可利用Illumina二代測(cè)序、PacBio三代測(cè)序與納米孔R(shí)NA直接測(cè)序平臺(tái)分析polyA，測(cè)序原理及流程如下：
 

1）基于Illumina平臺(tái)分析polyA尾
 

Illumina RNA-Seq的原理是通過(guò)富集mRNA（polyA富集）或去除rRNA，產(chǎn)生片段化的RNA序列，然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄生成雙鏈cDNA，在片段末尾加入測(cè)序接頭后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。cDNA分子聚集在流動(dòng)池，通過(guò)DNA合成體系中的3’端封鎖熒光標(biāo)記的核苷酸底物讀取熒光信號(hào)，從一端（單端測(cè)序）或兩端（成對(duì)末端測(cè)序）進(jìn)行測(cè)序。
 

常用的方法包括TAIL-Seq和PAL-Seq，借助于制備完整的包括polyA尾在內(nèi)的3’端mRNA測(cè)序文庫(kù)。首先將RNA與生物素化的3’端DNA接頭連接，并用RNase T1部分酶切，留下完整的polyA尾，隨后使用鏈霉親和素磁珠捕獲3’端片段。通過(guò)凝膠電泳篩選不同條帶，并與5’端接頭連接，為逆轉(zhuǎn)錄、文庫(kù)擴(kuò)增和測(cè)序提供完整的模板。如圖3所示，PAL-Seq和TAIL-Seq的不同在于DNA接頭，TAIL-Seq僅存在一個(gè)單鏈DNA接頭，測(cè)序過(guò)程需去除rRNA。而PAL-Seq技術(shù)除單鏈DNA接頭外，還存在一端與polyA尾和3’端接頭互補(bǔ)的DNA寡核苷酸序列，提高了連接效率，因此不需去除rRNA。
 

Illumina測(cè)序技術(shù)的不足在于，由于polyA的長(zhǎng)多聚物特性，容易產(chǎn)生PCR擴(kuò)增的偏倚，保真度較低，序列準(zhǔn)確性較低。

圖3 基于Illumina平臺(tái)的polyA尾測(cè)序方法

 

2）基于PacBio平臺(tái)分析PolyA尾
 

不同于Illumina短cDNA片段合成測(cè)序的方法，PacBio采用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)，在處理均聚物的效果優(yōu)于Illumina，可對(duì)全長(zhǎng)RNA分子進(jìn)行測(cè)序，提供有關(guān)polyA的長(zhǎng)度和序列信息。
 

常用方法包括FLAM-Seq和PAIso-Seq。如圖4所示，兩種方案的主要步驟是3’端延伸、逆轉(zhuǎn)錄、cDNA擴(kuò)增、環(huán)狀接頭連接和PacBio測(cè)序。
 

二者的不同點(diǎn)為：
 

FLAM-Seq首先選擇帶有polyA尾的mRNA，隨后對(duì)其進(jìn)行G/I加尾。逆轉(zhuǎn)錄引物由5’末端的PCR handle組成，然后在模板置換寡核苷酸（TSO）的情況下合成第二鏈，最后將合成的雙鏈cDNA擴(kuò)增并進(jìn)行PacBio測(cè)序。而PAIso-Seq首先與oligo dT結(jié)合，3’末端延伸，經(jīng)USER降解oligo dT寡核苷酸，隨后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增雙鏈cDNA并進(jìn)行PacBio測(cè)序。PacBio具備均聚物測(cè)序能力，可用于分析polyA尾的序列組成。

圖4 基于PacBio平臺(tái)的polyA尾測(cè)序方法

 

3）基于納米孔R(shí)NA直接測(cè)序平臺(tái)分析polyA尾
 

納米孔R(shí)NA直接測(cè)序平臺(tái)由Oxford NanoporeTechnologies（ONT）推出，與二代、三代測(cè)序相比，納米孔R(shí)NA直接測(cè)序技術(shù)分析polyA尾不需進(jìn)行PCR，流程如圖5所示，將3’端接頭連接至mRNA（含polyA），逆轉(zhuǎn)錄（可選操作）后連接至3’端測(cè)序接頭（與動(dòng)力蛋白連接），隨后被加載到納米孔形成的流動(dòng)池，施加電壓后，在動(dòng)力蛋白驅(qū)動(dòng)下，RNA由3’端至5’端通過(guò)納米孔，根據(jù)特異性電流信號(hào)分辨堿基序列。納米孔R(shí)NA直接測(cè)序平臺(tái)不需切斷mRNA序列，直接讀取全長(zhǎng)序列；該平臺(tái)不依賴于逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，可以同時(shí)表征序列的完整性、準(zhǔn)確性和核苷酸修飾。

圖5 基于納米孔R(shí)NA直接測(cè)序平臺(tái)的polyA尾檢測(cè)方法

 

03  結(jié)語(yǔ)

 

2018年Beverly M等使用內(nèi)切酶RNase T1進(jìn)行特異性切割，利用磁珠分離得到5’端polyA尾，隨后通過(guò)LC-MS有效分離不同分子量大小的核苷酸序列，從而定量分析polyA尾長(zhǎng)度分布。該方法是體外合成mRNA polyA尾的常用表征方法。
 

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們開始基于測(cè)序平臺(tái)分析polyA尾長(zhǎng)度。基于Illumina平臺(tái)的TAIL-Seq和PAL-Seq技術(shù)，以及第三代測(cè)序技術(shù)PacBio平臺(tái)，通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)對(duì)polyA尾或全長(zhǎng)mRNA進(jìn)行測(cè)序，可檢測(cè)polyA尾長(zhǎng)度和序列完整性。但二者均依賴于PCR擴(kuò)增cDNA，長(zhǎng)均聚物的存在導(dǎo)致PCR擴(kuò)增不可避免地存在偏差，可能對(duì)polyA尾長(zhǎng)和序列準(zhǔn)確性造成影響。ONT開發(fā)的直接測(cè)序方法，不依賴于逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增，可以實(shí)現(xiàn)polyA尾部長(zhǎng)度及序列準(zhǔn)確性的檢測(cè)，不存在PCR偏倚性。然而以TAILseq、PALseq、FLAMseq、PATseq及納米孔測(cè)序?yàn)榇�表的測(cè)序技術(shù)通量大、設(shè)備要求高，鑒于體外合成的mRNA通量較小，無(wú)法體現(xiàn)測(cè)序技術(shù)的高通量?jī)?yōu)勢(shì)。

 

參考文獻(xiàn)

[1] Beverly M, Hagen C, Slack O. Poly A tail length analysis of in vitro transcribed mRNA by LC-MS. Anal Bioanal Chem. 2018 Feb;410(6):1667-1677. doi: 10.1007/s00216-017-0840-6.

[2] Brouze A, Krawczyk PS, Dziembowski A, et al. Measuring the tail: Methods for poly(A) tail profiling. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2022 May 26:e1737. doi: 10.1002/wrna.1737.

[3] 藥品審評(píng)中心. 新型冠狀病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）. 2020.

[4] USP. Analytical Procedures for mRNA Vaccines–Draft. 2022.