一抗和二抗的種類和挑選合適的抗體需要考慮的因素

一 抗 選 擇 指 南

圖1一抗結(jié)構(gòu)

一抗是能和對應(yīng)抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白，種類包括單克隆抗體和多克隆抗體。檢測任何靶蛋白都有多種抗體可供選擇，一抗選擇主要考慮以下幾點因素：
 

（1）確定實驗樣本的種屬

首先確定所檢測樣本的種屬，如human、mouse、rat、dog、rabbit等。應(yīng)該選擇反應(yīng)種屬包含有樣本種屬的抗體。由于氨基酸序列同源性較高，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應(yīng)。如果樣本的種屬未列入抗體說明書上的反應(yīng)種屬中，并不意味著該抗體不適用于檢測該物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體驗證過。可以通過序列比對的方法來預(yù)測交叉反應(yīng)，可應(yīng)用Expasy和NCBI BLAST來進(jìn)行不同物種蛋白同源性比對。如果比對結(jié)果證明同源性較高，也是可以考慮測試下。
 

（2）確定實驗類型

確定自己的實驗類型，如ELISA、WB、IHC、IP、FC等，選擇包含該應(yīng)用的抗體。一般抗體說明書會列出該抗體經(jīng)試驗驗證過的實驗類型，如未提及并不意味著該抗體不適用于該應(yīng)用，而僅是說明尚未經(jīng)過該應(yīng)用的驗證，未包含應(yīng)用的具體情況可向廠家咨詢。
 

（3）抗體宿主物種的選擇

一般建議樣本種屬與抗體宿主物種的親緣性越遠(yuǎn)越好，不宜同源。對于免疫組化而言，如果使用未偶聯(lián)一抗和偶聯(lián)物標(biāo)記二抗，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)，例如：檢測小鼠樣本，則不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的一抗，而是選兔源的一抗，二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。如果直接使用偶聯(lián)物標(biāo)記一抗則不適用上述情況，對不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測方法，則抗體宿主物種的影響不大。
 

（4）單克隆與多克隆的選擇

在抗體抗原反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對較小，檢測靈敏度相對較低；而多克隆抗體特異性稍弱，但親和力較強(qiáng)，檢測靈敏度較高。如果使用多克隆抗體發(fā)現(xiàn)有很多無法去除的非特異條帶，建議換成單克隆抗體。
 

02一抗和二抗結(jié)合模式圖​

二抗是能和一抗結(jié)合的抗體，上面通常連有酶或熒光素等。二抗針對某一特定物種抗體均具有特異性，因而使用標(biāo)記的二抗可以免去對每一個一抗進(jìn)行標(biāo)記，節(jié)省了時間和費用；此外，一個一抗分子可以同時結(jié)合幾個二抗分子，從而使信號增強(qiáng)，提高了實驗靈敏度。二抗可以偶聯(lián)有幾種不同的標(biāo)記，可以是酶，熒光素，或生物素。

如何選擇二抗？通常情況下，某一特定的實驗中可能同時有幾種二抗可供選擇，如何能選擇到適合該實驗的二抗，需要綜合以下幾個方面進(jìn)行考慮：
 

（1）一抗的物種來源

根據(jù)一抗的物種來源選擇相應(yīng)的抗該物種的二抗。如果一抗是小鼠來源的抗體，二抗則選抗小鼠的二抗；如果一抗是兔來源抗體，則相應(yīng)的二抗需要選擇抗兔的二抗。
 

（2）一抗的亞型   

一般來說多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體。而單克隆抗體則相對復(fù)雜些，具有多種亞型，二抗除了要與一抗的種屬來源相一致，還需與一抗的亞型相匹配。如一抗亞型為小鼠IgG2a，那邊二抗需要抗小鼠IgG2a。
 

（3）二抗的種屬來源

一般來說，不同的種屬來源的二抗在實驗里沒有太多的差別。然而在一些特殊的實驗里，如雙標(biāo)實驗里，如果其中一個一抗是山羊來源的，一個是小鼠來源的，則相應(yīng)的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，此時二抗就不能選山羊或者小鼠來源的。選擇相應(yīng)的驢來源的二抗，就非常適合做類似雙標(biāo)的免疫實驗。
 

（4）選擇哪種形式的二抗，是整個IgG分子，F(xiàn)ab片段，還是F(ab')2片段？

整個IgG分子：此種抗體適用于多數(shù)情況。

Fab片段：它們只有一個結(jié)合位點，一般用來封閉內(nèi)源性免疫球蛋白。

F(ab')2片段：該種抗體是由兩個靠二硫鍵連接的用于結(jié)合抗原的Fab片段組成，這些抗體用在特定的情況中，如需要避免抗體與具有Fc受體的細(xì)胞結(jié)合的情況。
 

（5）二抗的偶聯(lián)標(biāo)記

一般來講，偶聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP等），熒光基團(tuán)（FITC, TR, PE）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗。對于IHC, WB和ELISA，常用的二抗是酶標(biāo)二抗，而細(xì)胞或組織的免疫熒光實驗和流式細(xì)胞術(shù)中通常使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗。
 

● 可提供兔多抗、鼠單抗10000余種，每年新增研發(fā)抗體近千種；

● 驗證應(yīng)用：ELISA,WB,IHC,IF,IP等實驗；100余種標(biāo)記二抗；

●  HRP、AP、Biotin、FITC、Alexa Fluor 488、CY3、熒光素等標(biāo)記物。