分子克隆技術(shù)中常見(jiàn)載體質(zhì)粒的分類(lèi)及結(jié)構(gòu)原件

分子克隆技術(shù)運(yùn)用的載體只要是指將DNA片段（目的基因）轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的一種能自我復(fù)制的DNA分子工具。常見(jiàn)的載體主要有質(zhì)粒、噬菌體、病毒等。今天咱們要聊的主角是質(zhì)粒。

一、什么是質(zhì)粒？
 

天然質(zhì)粒是可獨(dú)立于染色體外可自行復(fù)制的環(huán)狀DNA分子，通常帶有一些基因，特別是一些與抗生素耐藥性有關(guān)的基因，可以在不同的細(xì)菌細(xì)胞之間傳遞。質(zhì)粒主要存在于細(xì)胞、古生菌及真核生物中，比較特殊的在植物的葉綠體和線(xiàn)粒體等胞器中也有出現(xiàn)。

研究報(bào)道指出質(zhì)粒也不全是環(huán)狀的哦！1984年，在Streptomyces coelicoler（天藍(lán)色鏈霉菌）等放線(xiàn)菌以及在Borrelia hermsii（赫氏蜱疏螺旋體）等原核生物中，又相繼發(fā)現(xiàn)線(xiàn)形質(zhì)粒�；�于質(zhì)粒能夠攜帶基因，并且能夠在不同細(xì)胞中傳代基因的特性，質(zhì)粒被運(yùn)用到分子克隆技術(shù)中。在分子克隆技術(shù)中運(yùn)用的質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作而進(jìn)行人工改造得來(lái)，通常所用的是細(xì)菌載體質(zhì)粒。

它在分子克隆技術(shù)中的運(yùn)用是將某種目標(biāo)基因片段重組到質(zhì)粒中，構(gòu)成重組基因或重組體。將這種重組體經(jīng)微生物學(xué)的轉(zhuǎn)化技術(shù)，轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（如大腸桿菌）中，使重組體中的目標(biāo)基因在受體菌中得以繁殖或表達(dá)，從而改變寄主細(xì)胞原有的性狀或產(chǎn)生新的物質(zhì)。
 

細(xì)菌質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體，這些質(zhì)粒至少要有復(fù)制起點(diǎn)、篩選標(biāo)記和克隆位點(diǎn)。基礎(chǔ)的部分我們都來(lái)詳細(xì)了解下。

 

二、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)原件有哪些？

圖1 質(zhì)粒圖譜

1）復(fù)制起始位點(diǎn)(Origin of Replication，ORI)

ORI是一段DNA序列，質(zhì)粒復(fù)制的起始位置。DNA解螺旋酶可以作用于這段序列，然后DNA的雙鏈被分開(kāi)，復(fù)制隨即開(kāi)始。質(zhì)粒必須是能夠復(fù)制的，否則隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，質(zhì)粒的數(shù)量將會(huì)被迅速稀釋。

 

2）抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Gene)

抗生素抗性基因存在作用是快速篩選。在含有抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌，能夠生長(zhǎng)的就是含有目的質(zhì)粒，不含質(zhì)粒的細(xì)菌已經(jīng)被“殺死”了。

 

3）篩選標(biāo)記(Selectable Marker)

篩選已經(jīng)成功攝取質(zhì)粒的細(xì)胞。該篩選標(biāo)記需要區(qū)別于細(xì)菌中的抗性篩選。細(xì)菌抗性基因篩選用于質(zhì)粒擴(kuò)增過(guò)程，篩選標(biāo)記用于篩選或標(biāo)記轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞。篩選標(biāo)記通常是抗性篩選或者熒光蛋白。

 

4）啟動(dòng)子(Promoter)

啟動(dòng)子是能夠使基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動(dòng)子可以被RNA聚合酶辨別，并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子常位于目的基因上游100-1000bp位置處，是質(zhì)粒非常重要的一個(gè)元件，它決定著目的基因可以在何種細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，也決定蛋白質(zhì)的表達(dá)量。

 

5）多克隆位點(diǎn)(Multiple Cloning Site, MCS)

多克隆位點(diǎn)是一段短DNA片段，包括多個(gè)限制性酶切的單一位點(diǎn)，便于外源基因的插入。一般來(lái)說(shuō)，外源DNA片段越長(zhǎng)，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。在表達(dá)型質(zhì)粒中，MCS常處于啟動(dòng)子的后面。

 

6）引物結(jié)合位點(diǎn)(Primer Binding Site)

引物結(jié)合位點(diǎn)為一小段DNA片段，用來(lái)進(jìn)行質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增或者測(cè)序。

 

7）插入片段(Inserted Gene)

插入片段又稱(chēng)為外源性基因，是克隆到MCS中的基因、啟動(dòng)子或其他DNA片段，通常是人們所希望研究的遺傳元件。

三、質(zhì)粒的分類(lèi)有哪些？
 

1）表達(dá)質(zhì)粒：用于基因表達(dá)（基因功能的研究）。表達(dá)載體必須包含啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子序列和插入基因。啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)插入DNA轉(zhuǎn)錄生成RNA，合成的RNA上的終止子序列發(fā)出停止轉(zhuǎn)錄過(guò)程的信號(hào)。表達(dá)載體可以通過(guò)增強(qiáng)子序列增加蛋白質(zhì)或RNA的產(chǎn)量。表達(dá)載體可以在各種細(xì)胞類(lèi)型（哺乳動(dòng)物、酵母、細(xì)菌等）中驅(qū)動(dòng)表達(dá)，這在很大程度上取決于用于啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。

 

2）克隆質(zhì)粒：用于促進(jìn)DNA片段的克隆�？寺≥d體往往非常簡(jiǎn)單，通常只包含細(xì)菌抗性基因、復(fù)制起點(diǎn)和MCS。

 

3）報(bào)告質(zhì)粒：用于研究遺傳元件的功能。這些質(zhì)粒包含一個(gè)報(bào)告基因（例如，熒光素酶或GFP），可提供遺傳元件活性的讀數(shù)。

 

4）病毒質(zhì)粒：通過(guò)修飾的病毒基因組，有效地將遺傳物質(zhì)遞送到靶細(xì)胞中�？梢允褂眠@些質(zhì)粒來(lái)制造病毒顆粒，例如慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、AAV或腺病毒顆粒，從而高效感染靶細(xì)胞。

 

5）基因敲減質(zhì)粒：用于減少內(nèi)源基因的表達(dá)。通過(guò)表達(dá)靶向目的基因mRNA的shRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些質(zhì)粒具有可以驅(qū)動(dòng)短 RNA 表達(dá)的啟動(dòng)子。

 

6）基因工程質(zhì)粒：用于靶向和編輯基因組。通常使用CRISPR技術(shù)完成。