納米級(jí)分辨率顯微鏡Nanoimager在結(jié)締組織疾病中的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：920　發(fā)布日期：2023-3-27　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

賓夕法尼亞大學(xué)佩雷爾曼醫(yī)學(xué)院的研究人員在研究結(jié)締組織內(nèi)因肌腱炎而惡化的細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞所處的微環(huán)境發(fā)生病變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致染色質(zhì)產(chǎn)生空間和密度的不可逆變化，使其無(wú)法正常編碼遺傳信息。這項(xiàng)研究結(jié)果于2022年8月22日發(fā)表在Nature Biomedical Engineering上，指出了新療法（例如小分子療法）的可能性。

染色質(zhì)空間組織變化大多發(fā)生在納米尺度上（10-100nm），使用傳統(tǒng)的熒光顯微鏡來(lái)研究這一現(xiàn)象一直具有挑戰(zhàn)性。雖然基于高通量染色體構(gòu)象捕獲的方法能夠提供關(guān)于基因組組織有價(jià)值的信息，但這種方法通常需要大量的細(xì)胞，掩蓋了細(xì)胞間的異質(zhì)性。

在此研究中，作者使用Nanoimager單分子成像與功能分析系統(tǒng)，獲得了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的納米級(jí)高分辨率圖像，確定了結(jié)締組織的微觀化學(xué)物理環(huán)境在納米尺度上如何調(diào)節(jié)染色質(zhì)的組織變化，為治療結(jié)締組織疾病提供了新的治療策略。

研究結(jié) 果

1. 組織惡化改變hTCs的染色質(zhì)組織
已知組織惡化或衰老會(huì)改變致密結(jié)締組織的力學(xué)環(huán)境，因此作者使用超分辨率成像和定量分析來(lái)確定衰老和組織惡化是否會(huì)導(dǎo)致基因組組織的改變。

從三種不同供體（1.健康的年輕人、2.已確診肌腱病的年輕人、3.健康的老年人）的人體肌腱中分離出肌腱細(xì)胞（hTCs），超分辨率圖像顯示，健康年輕人的hTCs細(xì)胞核中，染色質(zhì)分布在整個(gè)細(xì)胞核中。然而，組蛋白H2B 出人意料地主要定位于已確診肌腱病的年輕人hTCs細(xì)胞核的核外周。為進(jìn)一步量化不同細(xì)胞類型中的染色質(zhì)組織，使用圖像分割軟件Voronoi進(jìn)行細(xì)分，結(jié)果顯示，與健康hTCs相比，無(wú)論核外圍還是核內(nèi)部的染色質(zhì)，病變hTCs的稀疏和致密染色質(zhì)間室都更加緊湊。這些數(shù)據(jù)表明，組織惡化和衰老都影響hTCs中染色質(zhì)組織的空間不同模式。

圖1.（a）5um和300nm標(biāo)尺下的H2B 的STORM圖像。（b）單位面積內(nèi)組蛋白H2B在核邊界和核內(nèi)部區(qū)域內(nèi)的定位數(shù)量比例。（c）是（a）中的組蛋白H2B經(jīng)Voronoi渲染后的數(shù)據(jù)，紅色是小的Voronoi多邊形，具有較高的組蛋白 H2B密度；藍(lán)色是大的Voronoi多邊形，具有較低的組蛋白 H2B密度。（d）年輕、肌腱病和老年供體hTCs致密染色質(zhì)室中染色質(zhì)凝縮的變化。

2. 基質(zhì)剛度改變hMSCs中的染色質(zhì)組織
組織(包括肌腱組織)具有很大的剛度范圍，組織變性能改變細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的化學(xué)物理環(huán)境。因此，作者假設(shè)，病變hTCs(或其祖細(xì)胞)基因組組織的變化可能是由惡化的組織微環(huán)境中的異�；瘜W(xué)-力學(xué)信號(hào)驅(qū)動(dòng)的，特別是由組織剛度的變化引起的。

為了評(píng)估生理和病理相關(guān)的生物物理信號(hào)如何在納米尺度上影響基因組組織，作者選擇了人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）這種可以根據(jù)基質(zhì)剛度來(lái)適應(yīng)表型的細(xì)胞，用這些在不同基質(zhì)上培養(yǎng)的模型細(xì)胞來(lái)優(yōu)化染色質(zhì)的定量超分辨率成像，并記錄不同的基因組組織的變化。數(shù)據(jù)表明，基質(zhì)剛度在納米尺度上調(diào)控了hMSCs的染色質(zhì)在空間上的組織和凝縮。

圖2.（a）培養(yǎng)在三種不同基質(zhì)上的hMSCs內(nèi)組蛋白H2B的STORM圖像。在Stiff和Glass兩組里，H2B在核內(nèi)分布更為均一，而在Soft組里，H2B則更多分布于核外圍。（b）單位面積內(nèi)組蛋白H2B在核邊界和核內(nèi)部區(qū)域內(nèi)的定位數(shù)量比例。（c）是（a）中的組蛋白H2B經(jīng)Voronoi渲染后的數(shù)據(jù)，紅色是小的Voronoi多邊形，具有較高的組蛋白 H2B密度；藍(lán)色是大的Voronoi多邊形，具有較低的組蛋白 H2B密度。（d）三種不同基質(zhì)上hMSCs細(xì)胞核致密染色質(zhì)室染色質(zhì)凝縮的變化

3. 基質(zhì)剛度改變hMSCs的組蛋白甲基化水平
接著，作者研究了基質(zhì)剛度是否也會(huì)導(dǎo)致活性染色質(zhì)（標(biāo)記物為H3K4me3）和異染色質(zhì)（標(biāo)記物為H3K27me3）的定位和凝縮狀態(tài)的變化。

作者用兩種特定組蛋白修飾的抗體對(duì)hMSCs進(jìn)行標(biāo)記，并獲得了三種基質(zhì)條件下的超分辨率圖像。H3K4me3的熱圖和定量分析表明，與玻璃基質(zhì)培養(yǎng)的hMSCs相比，在硬基質(zhì)培養(yǎng)的hMSCs中H3K4me3的水平略有升高，而在軟基質(zhì)培養(yǎng)的hMSCs中，H3K4me3的水平顯著降低。這些數(shù)據(jù)與前面描述的H2B凝縮分析一致，表明活性組蛋白標(biāo)記的丟失與軟基質(zhì)上染色質(zhì)凝縮的增加相關(guān)。相反，與玻璃基質(zhì)相比，H3K27me3在硬基質(zhì)上的含量較低(特別是在核內(nèi)部)，而在軟基質(zhì)上的含量較高(特別是在核外圍)。這些結(jié)果表明，外周染色質(zhì)定位的增加和軟基質(zhì)上染色質(zhì)凝縮的增加與H3K27me3水平的增加進(jìn)一步相關(guān)，這表明軟基質(zhì)可能導(dǎo)致基因抑制。

在觀察到基質(zhì)剛度在納米尺度上調(diào)控染色質(zhì)的組織，以及基質(zhì)依賴性染色質(zhì)重構(gòu)與組蛋白甲基化標(biāo)記水平的變化相關(guān)后，作者進(jìn)一步研究了zeste同源物2 (EZH2，催化H3K27me3)的甲基轉(zhuǎn)移酶增強(qiáng)子的作用，數(shù)據(jù)表明基質(zhì)剛度通過(guò)改變hMSCs中的細(xì)胞收縮力和組蛋白甲基化狀態(tài)來(lái)調(diào)節(jié)染色質(zhì)的空間組織和凝縮。

圖3.（a）和（c）分別是H3K4me3和H3K27me3的STORM圖像。（b）和（d）是在不同的基質(zhì)上培養(yǎng)的hMSCs中，在單位面積內(nèi)在核邊界和核內(nèi)部區(qū)域內(nèi)H3K4me3和H3K27me3的定位數(shù)量比例。（e）是三種不同基質(zhì)上培養(yǎng)的經(jīng)GSK和不經(jīng)GSK處理的hMSCs細(xì)胞核中組蛋白H2B數(shù)據(jù)，經(jīng)Voronoi渲染后，紅色是小的Voronoi多邊形，具有較高的組蛋白 H2B密度；藍(lán)色是大的Voronoi多邊形，具有較低的組蛋白 H2B密度。（f）使用和不使用GSK處理時(shí)，核邊界和核內(nèi)區(qū)域之間H2B定位的變化被量化為核邊界單位面積上H2B定位的數(shù)量與核內(nèi)區(qū)域單位面積上H2B定位的總數(shù)之比。（g）與對(duì)照組hMSCs相比，GSK處理的hMSCs中致密染色質(zhì)凝縮水平的變化。

4. 染色質(zhì)重構(gòu)的預(yù)測(cè)
異染色質(zhì)的形成以前被認(rèn)為是多種機(jī)制的結(jié)果，包括染色質(zhì)和染色質(zhì)相關(guān)蛋白（如HP1α）的液-液相分離、連接蛋白組蛋白H1中和靜電電荷和轉(zhuǎn)錄沉默。如前所述，已知特定的表觀遺傳標(biāo)記與濃縮異染色質(zhì)或開(kāi)放性常染色質(zhì)相關(guān)。然而，表觀遺傳調(diào)控因子對(duì)染色質(zhì)組織的影響尚未完全了解，乙�；图谆膭�(dòng)力學(xué)是否能改變?nèi)旧|(zhì)的凝縮尚不清楚。為了探索這些，并確定觀察到的基質(zhì)剛度對(duì)染色質(zhì)凝縮的影響是否是組蛋白甲基化狀態(tài)變化的結(jié)果，作者開(kāi)發(fā)了一個(gè)模擬異染色質(zhì)形成的相場(chǎng)模型。這個(gè)模型概括了組蛋白甲基化水平的基質(zhì)依賴性變化如何影響細(xì)胞核染色質(zhì)的空間組織的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為乙酰化和甲基化水平與相分離競(jìng)爭(zhēng)并影響染色質(zhì)組織提供了數(shù)據(jù)支持。

圖4.（a）甲基化的增加對(duì)染色質(zhì)組織的影響，藍(lán)色和紅色分別代表常染色質(zhì)和異染色質(zhì)富集的區(qū)域。（b）異染色質(zhì)簇的大小與甲基化水平的比例關(guān)系。（c）核邊界異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域（BHDs）厚度與甲基化水平的比例關(guān)系。（d）在軟或硬基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)測(cè)量和模型預(yù)測(cè)的核邊界和核內(nèi)部異染色質(zhì)百分比。左邊圖像對(duì)應(yīng)的是前圖中按照Voronoi多邊形大小編碼的H2B顏色的STORM圖像。右邊的圖像與模型預(yù)測(cè)相對(duì)應(yīng)，藍(lán)色為常染色質(zhì)，紅色為異染色質(zhì)。（e）在軟基質(zhì)上培養(yǎng)的經(jīng)GSK343處理或不經(jīng)GSK343處理的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)測(cè)量和模型預(yù)測(cè)的核邊界和核內(nèi)部異染色質(zhì)百分比。左邊圖像對(duì)應(yīng)的是前圖中按照Voronoi多邊形大小編碼的H2B顏色的實(shí)驗(yàn)STORM圖像。右邊的圖像與模型預(yù)測(cè)相對(duì)應(yīng)，藍(lán)色為常染色質(zhì)，紅色為異染色質(zhì)。

5. 染色質(zhì)在動(dòng)態(tài)力學(xué)信號(hào)下快速重組
現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，基質(zhì)剛度通過(guò)影響細(xì)胞相容性和下游甲基轉(zhuǎn)移酶活性來(lái)改變?nèi)旧|(zhì)的組織和定位，但這種靜態(tài)時(shí)不變的力學(xué)信號(hào)不能復(fù)制主動(dòng)負(fù)載細(xì)胞環(huán)境中重構(gòu)的動(dòng)態(tài)和時(shí)變特征。因此，作者接下來(lái)研究了生物物理環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化如何影響hMSC的細(xì)胞核在納米尺度上的染色質(zhì)組織。作者使用原位基質(zhì)增強(qiáng)系統(tǒng)來(lái)評(píng)估人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中H2B納米空間組織和染色質(zhì)凝縮的變化。細(xì)胞在“硬化水凝膠”系統(tǒng)上培養(yǎng)，該系統(tǒng)提供了基質(zhì)剛度從軟（約3kPa）到硬（約30kPa）的力學(xué)狀態(tài)的快速變化。H2B密度的熱圖顯示，硬化后的最初6小時(shí)，染色質(zhì)主要定位于核周邊，硬化后6～48h，染色質(zhì)從核周邊向核內(nèi)部不斷重新分布。染色質(zhì)空間組織的這些變化伴隨著稀疏和致密染色質(zhì)室的凝縮狀態(tài)的持續(xù)下降。

有趣的是，硬化后2h開(kāi)始凝縮變化，因此在空間組織變化之前，這表明染色質(zhì)的解聚可能導(dǎo)致其在細(xì)胞核中的空間重構(gòu)。硬化后18小時(shí)，解凝縮量達(dá)到起始值的60%左右，并持續(xù)至第7天。作者接下來(lái)研究了肌動(dòng)球蛋白驅(qū)動(dòng)的收縮力在染色質(zhì)組織和響應(yīng)基質(zhì)硬化的縮合中的作用。數(shù)據(jù)表明，ECM-硬化介導(dǎo)的染色質(zhì)解致密化和從hMSC細(xì)胞核邊界到內(nèi)部的再分布需要肌動(dòng)球蛋白為基礎(chǔ)的細(xì)胞收縮。總之，這些數(shù)據(jù)表明，動(dòng)態(tài)生物物理擾動(dòng)以復(fù)雜而快速的方式調(diào)節(jié)hMSCs細(xì)胞核中的納米尺度的染色質(zhì)組織。

圖5.（a）硬化后0-48h，組蛋白H2B從核外圍到核內(nèi)部連續(xù)重分布的STORM圖像。（b）核邊界H2B定位總數(shù)與核內(nèi)區(qū)域H2B定位總數(shù)的比值。（c）硬化后0-48h，hMSCs內(nèi)致密染色質(zhì)室中染色質(zhì)凝縮的變化。（d）在加/不加Y27處理硬化后不同時(shí)間的水凝膠上培養(yǎng)的hMSCs，單位面積核邊界H2B定位總數(shù)與核內(nèi)部H2B定位總數(shù)之比，表明Y27在硬化后阻止了染色質(zhì)從核邊界到核內(nèi)部的重新定位。（e）在加/不加Y27的硬化水凝膠上培養(yǎng)的hMSCs中致密染色質(zhì)室染色質(zhì)凝縮的變化，Y27處理可防止硬化后致密染色質(zhì)凝縮隨時(shí)間的減少。（f）示意圖顯示ECM硬化如何通過(guò)肌動(dòng)球蛋白為基礎(chǔ)的細(xì)胞收縮來(lái)調(diào)節(jié)hMSCs中的染色質(zhì)分布和凝縮。ECM硬化使染色質(zhì)從邊界重新分布到hMSC核的內(nèi)部區(qū)域，導(dǎo)致染色質(zhì)去凝，這需要細(xì)胞的收縮。

6. “惡化”信號(hào)改變hTCs的染色質(zhì)組織
鑒于生物物理信號(hào)對(duì)體外納米尺度上染色質(zhì)組織的影響的結(jié)果，作者接下來(lái)提出了初步假設(shè)：化學(xué)物理環(huán)境（例如軟ECM、缺氧和炎癥）的惡化信號(hào)可能引起納米尺度上染色質(zhì)重構(gòu)，并導(dǎo)致年輕健康的hTCs呈現(xiàn)與老年或惡化的（肌腱�。﹉TCs相似的特征。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者首先在玻璃、硬（30kPa）或軟（3kPa）基質(zhì)上在基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)從年輕健康供體分離的hTCs 2天。超分辨圖像再次顯示了H2B定位，在玻璃基質(zhì)上培養(yǎng)的年輕健康hTCs的細(xì)胞核中形成明顯的H2B納米結(jié)構(gòu)域。有趣的是，年輕hTCs在硬基質(zhì)上培養(yǎng)時(shí)，整個(gè)細(xì)胞核中稀疏和濃縮的染色質(zhì)室的染色質(zhì)凝縮減少，達(dá)到與在玻璃基質(zhì)上培養(yǎng)的老年hTCs相似的水平。而在軟基底上培養(yǎng)時(shí)，染色質(zhì)重新定位到核周邊并變得更加致密，特別是在核內(nèi)部，這與惡化的hTCs相似�？偟膩�(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明，肌腱老化或微損傷引起的組織力學(xué)性質(zhì)改變可能會(huì)導(dǎo)致疾病中染色質(zhì)組織的一些異常變化。

圖6.（a）培養(yǎng)在三種不同基質(zhì)上的hTCs內(nèi)組蛋白H2B的STORM圖像。（b）核邊界單位面積上H2B定位總數(shù)與核內(nèi)區(qū)域H2B定位總數(shù)的比例，顯示在軟基質(zhì)上培養(yǎng)的hTCs中H2B重新定位到核邊界。（c）組蛋白H2B的STORM圖像，展示在常氧條件下年輕的和肌腱病的hTCs中H2B的定位變化，以及在低氧條件下年輕的hTCs中的H2B定位變化。（d）核邊界單位面積上H2B定位總數(shù)與核內(nèi)區(qū)域H2B定位總數(shù)的比值，顯示缺氧條件下年輕hTCs中H2B重新定位到核邊界。（e）組蛋白H2B的STORM圖像，展示的是在有/沒(méi)有IL-1β和TNF-α的玻璃基質(zhì)上培養(yǎng)的hTCs中H2B定位的變化。（f）核邊界單位面積上H2B定位總數(shù)與核內(nèi)區(qū)域H2B定位總數(shù)的比例，顯示hTCs在經(jīng)炎癥因子處理后H2B的重新定位到核邊界。

7. 惡化影響hTCs的力學(xué)靈敏度
鑒于hTCs能夠通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)的空間組織和凝縮來(lái)迅速應(yīng)對(duì)力學(xué)環(huán)境的變化，作者最后研究了組織惡化或老化如何影響其力學(xué)敏感性。超分辨成像結(jié)果顯示，年輕、肌腱病和老年hTCs中的H2B在硬化后4小時(shí)內(nèi)主要定位于核周邊。硬化24小時(shí)后，年輕hTCs中的染色質(zhì)在整個(gè)細(xì)胞核中變得更均勻地分散和去致密。老化細(xì)胞對(duì)基質(zhì)剛度的增加也有相同的反應(yīng)趨勢(shì)，但在染色質(zhì)解致密化方面程度較低。然而，當(dāng)肌腱病變細(xì)胞在硬化的水凝膠上培養(yǎng)時(shí)，染色質(zhì)的空間組織沒(méi)有變化，特別是在核周邊染色質(zhì)失活的程度，與年輕和老年細(xì)胞相比明顯更低。這些數(shù)據(jù)表明，hTCs染色質(zhì)組織的長(zhǎng)期改變可能與惡化引起的力學(xué)靈敏性喪失有關(guān)。

圖7. （a）硬化后4h和24h，不同組的hTCs組蛋白H2B分布的STORM圖像。（b）核邊界單位面積上H2B定位總數(shù)與核內(nèi)區(qū)域H2B定位總數(shù)的比例，顯示在肌腱病組的hTCs在基質(zhì)硬化后H2B重新定位到核內(nèi)部的過(guò)程沒(méi)有及時(shí)反應(yīng)。（c）硬化24 h后致密染色質(zhì)室中染色質(zhì)凝縮的變化。

研究結(jié) 論

在這項(xiàng)研究中，基于強(qiáng)大的超分辨率顯微鏡Nanoimager，作者在納米尺度上展示了健康纖維組織和祖細(xì)胞細(xì)胞核中染色質(zhì)組織對(duì)力學(xué)性能具有高度的響應(yīng)性，這種響應(yīng)性依賴于獨(dú)特的細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)和組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)變化，這對(duì)如何以及何時(shí)應(yīng)用臨床療法治療人類疾病具有重要的指導(dǎo)意義。

圖8.基質(zhì)的高硬度改變了以肌動(dòng)球蛋白為基礎(chǔ)的細(xì)胞收縮性，從而促進(jìn)肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的形成和局部粘附，并調(diào)節(jié)染色質(zhì)修飾物(例如HDAC和EZH2)進(jìn)出細(xì)胞核。這些表觀遺傳修飾物通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白乙�；�/甲基化水平改變?nèi)旧|(zhì)在納米尺度上的空間組織和凝縮。

Nanoimager

Nanoimager作為新一代單分子成像系統(tǒng)的標(biāo)志性代表，相比傳統(tǒng)的熒光顯微鏡，在技術(shù)的先進(jìn)性方面具有巨大突破。它克服了光衍射的限制，橫向分辨率可達(dá)20nm、軸向分辨率可達(dá)50nm，并支持同時(shí)雙色成像和順序四色成像，可在空間上對(duì)形態(tài)學(xué)和亞細(xì)胞動(dòng)態(tài)進(jìn)行精確的納米級(jí)研究，進(jìn)一步揭示分子相互作用細(xì)節(jié)，使深入探索變得更簡(jiǎn)單。

Nanoimager 集成多種高端成像技術(shù)于一體，具備dSTORM（隨機(jī)光學(xué)重建顯微技術(shù)）、PALM（光激活定位顯微技術(shù)）、Single Particle Tracking（單分子動(dòng)態(tài)追蹤與定量）、smFRET（單分子FRET技術(shù)）和Confocal（共聚焦技術(shù)）等技術(shù)模塊，這些優(yōu)勢(shì)使它成為信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤和外泌體標(biāo)志物、病毒增殖和裝配、細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)表征等研究領(lǐng)域在單分子水平上進(jìn)行顯微分析的重要幫手。

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