雙螢光素酶報告基因檢測原理及應(yīng)用

報告基因是一類使表達(dá)產(chǎn)物易于被檢測的基因，其作用原理是將報告基因的編碼序列及其表達(dá)調(diào)控序列與目的基因融合形成嵌合基因，在調(diào)控序列的作用下進(jìn)行表達(dá)，通過對報告基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測來評價目的基因的表達(dá)狀況。

常見的報告基因包括螢光素酶（Luciferase）、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）、β-半乳糖苷酶（β-gal）、分泌性人胎盤堿性磷酸酶（SEAP）和綠色熒光蛋白（GFP）等。
 

螢光素酶（Luciferase）是一類在生物體內(nèi)能夠催化熒光素或脂肪醛氧化發(fā)光的酶，從自然界能夠發(fā)光的生物體內(nèi)分離獲得。由于特異性強(qiáng)、靈敏度高、內(nèi)源性低、檢測不受細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)的影響等優(yōu)點，螢光素酶被作為報告基因（標(biāo)記蛋白）而被廣泛應(yīng)用。
 

雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在單螢光素酶報告基因的基礎(chǔ)上引入了“內(nèi)參對照”報告基因，這樣可以在最大程度上減小細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞生長狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對于實驗的影響，使得實驗結(jié)果更為可信。

應(yīng)用

應(yīng)用1：順式作用原件研究

雞骨形態(tài)生成蛋白15（bone morphogenetic protein 15, BMP15）基因不同啟動子截短體報告載體的雙螢光報告結(jié)果顯示，BMP15基因啟動子-153-1 bp 為核心區(qū)域。

應(yīng)用2：細(xì)胞信號通路研究

圖2 檢測不同濃度的HLY78系列衍生物對Wnt信號通路報告基因TOPflash的螢光素酶活性影響
 

通過檢測不同濃度的HLY78系列衍生物對Wnt信號通路報告基因TOPflash的螢光素酶活性影響，篩選出HLY78和HLY119對Wnt信號通路有抑制作用。

應(yīng)用3：反式作用因子研究

圖3 在-562- -200位點是Runx1 發(fā)揮對Mrgprd 基因的轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵位點

圖4 Runx1 通過+70 ～ +143位點序列促進(jìn)Mrgprd基因轉(zhuǎn)錄
 

Runx1（轉(zhuǎn)錄因子）對Mrgprd基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制可能有多種，并非只是通過結(jié)合在Mrgprd基因上游的結(jié)合位點來直接調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。

應(yīng)用4：miRNA靶點研究

圖5 miRNA靶點研究案例
 

miR-1269b過表達(dá)可明顯降低293T細(xì)胞中METTL3-WT的螢光素酶活性，但對METTL3-MUT的活性沒有顯著影響，表明miR-1269b可靶向METTL3 3’UTR，負(fù)調(diào)控GC細(xì)胞中METTL3的表達(dá)。

注：應(yīng)用數(shù)據(jù)均來自文獻(xiàn)

參考文獻(xiàn)

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